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6207220

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】现要设计引物扩增后测序，无各个条件都满足的引物，请问什么条件是最重�已有2人参与

是这样的 本人纯新手
现要补齐DNA全长
PCR扩增后直接测序
用PP5搜索不到比较好的引物
满足了这个满足不了那个
那么在引物设计原则里面 什么是比较重要的
引物长度 形成二聚体 发夹结构的△G等等？

还有一个问题。。为什么我有时输到PP5里面搜索
同样一段序列 同样的设置 但是搜索结果不一样啊
太忧伤了。。
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1楼2011-03-21 12:09:31
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连接不上有很多种情况，首先想到的是连接酶的问题，如果连接酶没有问题那么看片段末端是不是有啥情况。比如扩增后是否进行了酶切，酶切之后末端是突出端还是平端，都可以根据情况选择不同的办法，另外，如果切了看内切酶是不是有污染把突出端的几个碱基切掉了导致再连连不上了。又或者你PCR之后产物放在冰箱里时间过长，产物发生自连了那就先65度5分钟退火一下，总之做生物实验小问题多多，在每一步里面好好注意一下就好啦。
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5楼2011-03-31 13:47:12
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-03-21 15:04:15
别那么纠结，要是已知序列就在要扩的两端截一段，用引物计算器算一下，别太不靠谱就可以了，个人认为如果要求不高的话，二聚体可以切胶去掉，发卡结构调PCR的温度就可以，长度17到25就行。
如果你要做DNA全长，可能片段比较大吧，这可能就需要用一些长片段的酶了，或者看GC含量高不高，看酶是否耐受高GC，另外后续要测序，酶就需要用高保真的酶了。
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2楼2011-03-21 12:46:16
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6207220

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-03-21 12:46:16:
别那么纠结，要是已知序列就在要扩的两端截一段，用引物计算器算一下，别太不靠谱就可以了，个人认为如果要求不高的话，二聚体可以切胶去掉，发卡结构调PCR的温度就可以，长度17到25就行。
如果你要做DNA全长，可 ...

感谢回复
要扩的片段不长 大概1500bp左右
且这边主要两个基因已经测出来 但是就接不上
请问这样感觉的引物可以使用吗？
谢谢
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3楼2011-03-21 13:11:21
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豆豆鱼

木虫 (正式写手)
最重要就是不要有错配，GC含量40-60，上下游Tm值相差不要超过5摄氏度，其他的不是很重要。
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4楼2011-03-21 19:14:50
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