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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切不出结果
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30937747

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切不出结果

我将一个质粒热转至E.coli中扩增后,用EcoRⅠ酶切鉴定正确.将鉴定正确的质粒电转至农杆菌,在抗性平板上筛选扩增后,提取出来的质粒用EcoRⅠ再次鉴定,却怎么也切不开,条带从质粒大小的那个地方开始就开始出现拖尾,一直拖到400bp(如果酶切正确,400bp是最小的一个片段).中间都看不到明显的条带.
请问怎么解决
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1楼 2011-01-20 14:38:41
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poog502

木虫 (正式写手)
★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流！ 2011-01-20 19:40:59
30937747(金币+1): 2011-01-20 20:20:44
1\农杆菌的质粒很少的，你这样酶切看的见条带吗？
2、更换所用的器皿、水、buffer，之前也是切不开，换个之后重新酶切就好了。
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2楼2011-01-20 14:55:05
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-01-20 19:41:05
30937747(金币+1): 2011-01-20 20:23:05
是不是酶切时间过久？可以尝试一下37℃一个小时？

无图无真相，
最好有三个孔，第一个酶单切，第二个酶单切，两个酶双切

理论上，前两个泳道都是一条条带，同样大小，双酶切的有两条
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3楼2011-01-20 15:06:53
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30937747

木虫 (小有名气)

...

引用回帖:
Originally posted by 30937747 at 2011-01-20 14:38:41:
我将一个质粒热转至E.coli中扩增后,用EcoRⅠ酶切鉴定正确.将鉴定正确的质粒电转至农杆菌,在抗性平板上筛选扩增后,提取出来的质粒用EcoRⅠ再次鉴定,却怎么也切不开,条带从质粒大小的那个地方开始就开始出现拖尾,一 ...

我想说.我是把一个质粒转到农杆菌里面去了.再把我转进去的提出来
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4楼2011-01-20 20:21:30
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30937747

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-01-20 14:55:05:
1\农杆菌的质粒很少的，你这样酶切看的见条带吗？
2、更换所用的器皿、水、buffer，之前也是切不开，换个之后重新酶切就好了。

额..我好像说错了.我本来就是单酶切,有五个位点
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5楼2011-01-20 20:22:57
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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)
★ ★
30937747(金币+2): 2011-01-21 23:14:31
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-01-30 19:03:53
有可能是你提的质粒质量不好，被核酸酶污染了，出现了smear现象。建议第一，设一个阳性对照，就是你之前的那个质粒，同样用ECOR1一起切，对照能出来，那说明酶没问题。第二，用另一种酶或者几种酶去切，单切就好，如果都是这样的smear条带，那就肯定是质粒的问题了，重新提取。
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6楼2011-01-20 23:58:01
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)
30937747(金币+1): 2011-01-21 23:14:21
农杆菌中我一般只pcr验证就可以了 从来不酶切验证。。。
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7楼2011-01-20 23:58:50
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张曼19880101

铜虫 (小有名气)
★
30937747(金币+2): 谢谢.我过完年再试试 2011-01-30 09:48:31
dhd997(金币+1): 欢迎多交流 2011-02-16 10:45:00
引用回帖:
Originally posted by 30937747 at 2011-01-20 14:38:41:
我将一个质粒热转至E.coli中扩增后,用EcoRⅠ酶切鉴定正确.将鉴定正确的质粒电转至农杆菌,在抗性平板上筛选扩增后,提取出来的质粒用EcoRⅠ再次鉴定,却怎么也切不开,条带从质粒大小的那个地方开始就开始出现拖尾,一 ...

是不是质粒没提好？酶切体系的试剂用新的，再不行用双酶切试试，以前我做的时候单酶切3次都不成功，最后用双酶切就切开了~~希望对你有帮助~~~~
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8楼2011-01-29 15:22:57
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380665135

新虫 (初入文坛)
★
30937747(金币+3): 额.是的.所以我想知道是个什么修饰作用 2011-02-16 09:14:07
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-16 10:44:47
可能是你的质粒被农杆菌修饰了吧
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9楼2011-02-15 20:06:20
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