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wangdandelia木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】DNA退火 已有7人参与
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大家谁做过单链DNA片段退火，形成双链的实验呢？还有DNA的磷酸化，都需要注意哪些问题？ 我做了很多歌DN片段的退火和磷酸化，在确定载体没有问题的情况下，都不能与退火形成的DNA双链连接，哪个细节出错了呢。。。 我是先进行DNA退火，然后再将退火后的双链DNA进行磷酸化，具体步骤如下： 退火体系： 100pmol/uL的互补DNA单链各自加入10uL，再加入去离子水80uL，组成了100uL的体系，混匀，在PCR仪中退火，退火步骤如下：95摄氏度3min；每8s降低0.1摄氏度，降至25摄氏度，然后4摄氏度长期保存。 退火后的双链DNA进行磷酸化，用的是NEB公司的T4 多聚核苷酸激酶，是50uL体系：加入激酶Buffer 5 uL， DNA 15uL， T4多聚核苷酸激酶1 uL，ddH2O 29uL， 于37℃ 温育30min， 然后65℃ 20min 热失活。 以上是我的具体实验步骤，谢谢！ [ Last edited by wangdandelia on 2011-1-10 at 09:27 ] |
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