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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNA退火
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wangdandelia

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】DNA退火 已有7人参与

大家谁做过单链DNA片段退火，形成双链的实验呢？还有DNA的磷酸化，都需要注意哪些问题？
我做了很多歌DN片段的退火和磷酸化，在确定载体没有问题的情况下，都不能与退火形成的DNA双链连接，哪个细节出错了呢。。。

我是先进行DNA退火，然后再将退火后的双链DNA进行磷酸化，具体步骤如下：
退火体系： 100pmol/uL的互补DNA单链各自加入10uL，再加入去离子水80uL，组成了100uL的体系，混匀，在PCR仪中退火，退火步骤如下：95摄氏度3min；每8s降低0.1摄氏度，降至25摄氏度，然后4摄氏度长期保存。

退火后的双链DNA进行磷酸化，用的是NEB公司的T4 多聚核苷酸激酶，是50uL体系：加入激酶Buffer 5 uL， DNA 15uL， T4多聚核苷酸激酶1 uL，ddH2O 29uL， 于37℃ 温育30min， 然后65℃ 20min 热失活。

以上是我的具体实验步骤，谢谢！

[ Last edited by wangdandelia on 2011-1-10 at 09:27 ]
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1楼 2011-01-09 22:15:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-10 09:06:20
你的单链多长？我通常是两条59nt互补形成双链，毫无鸭梨~次次成功
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2楼2011-01-09 23:43:55
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jinhx87

至尊木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
2楼得能否把具体过程详细的记录下来呢？
期待着。
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3楼2011-01-10 06:57:52
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-01-09 23:43:55:
你的单链多长？我通常是两条59nt互补形成双链，毫无鸭梨~次次成功

我的DNA单链是21个碱基组成的小DNA片段。
可以说详细点吗？我这两天需要做这个实验，谢谢啊~！

[ Last edited by wangdandelia on 2011-1-10 at 09:28 ]
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4楼2011-01-10 09:10:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 09:10:13:

我的DNA单链是21个碱基组成的小DNA片段。
可以说详细点吗？我这两天需要做这个实验，谢谢啊~！

[ Last edited by wangdandelia on 2011-1-10 at 09:28 ]

我用的是碧云天的退火buffer（其实自己配的也一样，只是我懒）
然后先95℃充分变性，你的这种短片段，估计2min就足够了
然后每60~90s下降1度，使片段慢慢退火。
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5楼2011-01-10 09:54:21
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by jinhx87 at 2011-01-10 06:57:52:
2楼得能否把具体过程详细的记录下来呢？
期待着。

5楼
6楼2011-01-10 09:54:34
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-01-10 09:54:21:


我用的是碧云天的退火buffer（其实自己配的也一样，只是我懒）
然后先95℃充分变性，你的这种短片段，估计2min就足够了
然后每60~90s下降1度，使片段慢慢退火。

哦，好啊，我也试一试，谢谢啊，呵呵~！！请问DNA的浓度和体系都是按照参考说明上混合吗？
如果用这Buffer的话，是不是需要纯化才能进行T4 DNA多聚核苷酸激酶的磷酸化呢？
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7楼2011-01-10 11:13:57
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangdandelia at 2011-01-10 11:13:57:

哦，好啊，我也试一试，谢谢啊，呵呵~！！请问DNA的浓度和体系都是按照参考说明上混合吗？
如果用这Buffer的话，是不是需要纯化才能进行T4 DNA多聚核苷酸激酶的磷酸化呢？

是的，按说明书进行
但是因为退火buffer盐挺高的，所以要clean-up之后再进行下游实验
不过你的片段太短了，不好操作
得买专门用于短片段回收的清洁试剂盒，不然用普通的柱子，都无法挂上去的，直接一离心就没了
就算是沉淀也不好弄，太短了
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8楼2011-01-10 11:37:04
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
我是水中直接退火复兴，梯度降温和直接冰浴都试过，效果差不多

退火之后也没有磷酸化之类的处理

又一个问题就是你的感受态是不是够给力

感受态效率低是很多实验失败的主要因素，尤其是连接产物
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9楼2011-01-10 11:46:29
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wangdandelia

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2011-01-10 11:46:29:
我是水中直接退火复兴，梯度降温和直接冰浴都试过，效果差不多

退火之后也没有磷酸化之类的处理

又一个问题就是你的感受态是不是够给力

感受态效率低是很多实验失败的主要因素，尤其是连接产物

恩，谢谢美女，呵呵~我用的是电转化，有两个片段可以连接上，其余的都不能连接，我用空载体转化，效率还不错。。
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10楼2011-01-10 13:03:29
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