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微生物限度检查法方法验证结果报告
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微生物限度检查法方法验证结果报告 一、 细菌数、霉菌和酵母菌数计数验证结果 检品名称 生产单位 检验依据 2005年版药典微生物限度检查法 报告日期 2005．07．23 方法描述 取本品用灭菌好的研钵研细，取供试品 10g,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,摇匀,制成1:10均匀供试液，再取供试液1ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成1：100供试液（试验用稀释级）. 菌种名称 菌种代数 验证加菌数(CFU) 样品本底菌数 试验组 (样品+验证加菌数) 回收率(%)取两个平皿平均值 备注 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉菌 各菌株回收率={[(样品+验证加菌数) -样品本底菌数]÷验证加菌数}×100% (另:稀释对照组的菌回收率均应不低于70%.) 结论:本品经按《中国药典》微生物限度检查法中细菌数、霉菌和酵母菌数计数验证方法验证,结果表明可用常规法检查本品的霉菌和酵母菌数、细菌数. XXXXX单位(盖章) 日期: 控制菌检查 控制菌检查方法的验证 当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。 验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌（Stlmonella paratyphi B）[CMCC(B)26003] 乙型付伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B) [CMCC(B)50 094] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10 104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64 941] 验证方法 （1）试验组 取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。 （2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、松菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。 检查法 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。 阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 （1）大肠埃希菌（Escherichia coli） 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。 （2）取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 如MUG阳性、靛基质阳生，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。 若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色境检和适宜的生长试验，确认是否为大肠埃希菌。 表1 大肠埃希菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 曙红亚甲蓝琼脂 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边级整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。 麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，连续整齐，表面光滑，湿润 （2）大肠菌群（Coliform） 取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1：100的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。 胆盐乳糖发酵管若无菌、或有菌生长但不产酸产气、判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～28小时。 若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无菌孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平析上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。 表2 大肠菌群菌落形态特征 培养基 菌 落 形 态 曙红亚甲蓝琼脂 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。 麦康剀琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。 确证试验 从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。 根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。 表3 可能的大肠菌群数表 各供试品量的检出结果 可能的大肠菌群数N（个/g或 ml） 0.1g或0.1ml 0.01g或0.01ml 0.001g或0.001ml ＋＋＋－ ＋＋－－ ＋－－－ ＞103102＜N＜10310＜N＜102＜10 注：＋代表检出大肠菌群；－代表未检出大肠菌群 （3）沙门菌(Salmonella) 取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200 ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆机或其他适宜的方法混匀，培养18～24小时。 取上述培养物1，接种于10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康剀琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。 若平板上生长的菌落于表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养基进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。 表4 沙门菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 胆盐硫乳琼脂 无色或浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色 沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色 曙红亚甲蓝琼脂 无色或浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落 麦康剀琼脂 无色或浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色 （4）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100 ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配置的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养基呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。 若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。 绿脓菌素（Pyocyanin））试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3～5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1盐酸试液约1，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则，为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。 若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。 （5） 金黄色葡萄球菌（Stlmonella paratyphi B） 取供试液10ml（相当于供品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100 ml）的亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 表5 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 甘露醇氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7～1mm 卵黄氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm |
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