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lianyi1989

金虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】荧光定量pcr出现直线扩增曲线,求指导

最近做的一些列样品中有的样品出现来直线扩怎曲线的现象,不知什么原因,用的SYBR Green的方法,ABI7500仪器。因为其他的样品都没这种问题,所以一开始怀疑cDNA有问题,重新合成了,但是在做仍有这种问题,真是不知道什么原因,求各位同学们给些指导,谢谢大家啦
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lianyi1989(金币+1): 2011-01-01 12:59:47
重新设计引物,可能出现了非特异或者竞争性的东西
2楼2010-12-30 22:24:42
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lianyi1989

金虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-30 22:24:42:
重新设计引物,可能出现了非特异或者竞争性的东西

谢谢,但是我其他处理的样品没有这种问题啊,并且我用过两个引物做都是这种结果,所以我觉得是引物原因的可能性是不是比较小些?
3楼2011-01-01 13:01:30
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引用回帖:
Originally posted by lianyi1989 at 2011-01-01 13:01:30:


谢谢,但是我其他处理的样品没有这种问题啊,并且我用过两个引物做都是这种结果,所以我觉得是引物原因的可能性是不是比较小些?

我最近在用qPCR检测RNAi的效果
发现如果引物没设计好,然后模板量很低的话,扩出来的曲线就是很奇怪的

还真不是单一因素引起的
4楼2011-01-01 13:03:30
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wmjqy

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我也是用7500做的。从你的图像看,你这个根本cDNA模版就没有开链。这个可以有很多因素造成:1、退火温度和退火时间不恰当;2、可能根本就没有cDNA模版。如果是没有模版的话,那可能是你逆转录的问题了。在逆转录操作过程中RNA已经降解,或者DNA污染或者蛋白污染等情况都有可能导致逆转录失败,从而没有cDNA的合成。你逆转录之前有没有测量A260/A280,A230/A280比值是多少?如果以上都排除了,那就是你的源头 引物有问题了。得重新设计引物了。这是我用7500做的一个扩增曲线图。仅供参考
[

[ Last edited by wmjqy on 2012-5-23 at 23:10 ]
5楼2012-05-23 22:52:17
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yucuiyuan00

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
请问楼主你的这个问题解决了吗?我最近做Q-PCR也遇到了类似的问题,扩增曲线也近似直线,所以过来请教下,O(∩_∩)O谢谢
6楼2012-10-24 14:10:19
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