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木马王子

金虫 (正式写手)

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[资源] 【原创】逆境酶活性的测定总结

逆境酶活性的测定总结SOD、CAT、POD、MDA、H2O2等等等http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=10387235tm2c9wa1doo9saoa
CAT活性的测定采用chance(1955)法
   取鲜重0.5克的子叶，加5ml酶抽提液（50 mmol/L pH7.8 PBS+1.0mmol/L DTT+1% PVP
冰浴研磨，10000*g冷冻离心30min,得上清液。在3ml反应体系中含50mmol/LpH7.0 PBS1.9ml ,45mmol/L H2O2 1.0ml, 0.1ml酶液，连续记录25度下OD240nm吸收值变化。（下降）
过氧化物酶（POD）活力连续记录测定
 材料，试剂，设备
1. 材料：禾本科植物叶片（或其它植物组织）
2. 试剂：1）酶提取缓冲液：50mmol/L PBS（PH 7.8）内含5mmol/L亚硫酸氢钠（临用前加）
      2）酶活力测定缓冲液：0.05mol/L PBS (PH 7.0)
3 0.25%愈创木酚（溶于50%乙醇中）溶液（用前配制）
            4）0.75%H2O2
3 设备：电子天平，高速冷冻离心机，分光光度计，研钵，塑料离心管，刻度吸管，刻度试管，剪刀
 操作步骤
1. 酶液的制备
称取0.5g左右植物样品，记下实际质量后减碎与研钵，加入预冷的酶提取液5ml，置冰浴充分研磨。匀浆液全部转入塑料离心管，平衡后于10000g，4C下离心30min。上清夜全部倒入刻度试管，准确记下其体积，此上清夜即为酶液，冷冻待用。
   2．酶活力测定（间隔读数法）
1）分光光度计预热，波长为460nm
2）再比色杯内先加入2ml 0.05mol/L的PBS (PH 7.0) 和1ml 0.25%愈创木酚，再加入0.05ml酶液，最后加入0.1ml 0.75%H2O2 ，迅速颠倒混匀，插入比色架上，迅速把A460调至0并开始计时，30S读数，共3min。记录。

SOD酶活力测定方法
取鲜重0.5克的子叶，加5ml酶抽提液（50 mmol/L pH7.8 PBS+1% PVP）冰浴研磨，10000*g冷冻离心30min,得上清液。
PBS 2.3ml 2.4ml（最大管）
Met 0.2ml 195 mmol/L（缓冲液配制）
EDTA 0.1ml 3ｕM（同上）
酶液 0.1ml
NBT 0.2ml 1.125mmol/L（同上）
核黄素 0.1ml 60ｕM（同上）

MDA含量测定采用赵世杰等改进的方法：赵世杰，许长成，邹琦，等，植物中丙二醛测定方法的改进，植物生理学通讯，1994，30（3）：207~210
取0.5克叶片，加5.0ml 50 mM pH7.8 PBS匀浆，3000×g离心10 min，取2.0 ml上清液，加TBS（20％三氯乙酸＋0.5％硫代巴比妥酸）2.0 ml，混合后沸水浴30 min，冷却后再离心一次（4000×g, 10 min），分别测A450、A532、A600，进一步求得样品MDA含量。

MDA含量(μmol/g FW)=D×V(体积5/2)/FW（0.5g）
D=6.45×(A532—A600)--0.56A450

蛋白质含量测定    考马斯亮蓝法
  试剂考马斯亮蓝：100毫克溶于50毫升90%乙醇，加入85%（w/v）的磷酸100毫升，蒸馏水定容到1000毫升。
1、  称取2克鲜样放入研钵中，加2毫升蒸馏水匀浆，转至离心管中，再用6毫升蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液一并放入研钵中，放置半小时到一小时提取，4000转/分离心20分钟，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，定容至10毫升待测。
2、吸提取液0.1毫升（重复一次），放入具塞刻度试管，加入5毫升考马斯亮蓝，混合放置2分钟用10毫米光径比色杯在595nm下比色，用蒸馏水做空白对照，得OD值，通过标准曲线计算。

样品蛋白质含量（μ/g.FW）=OD*10/0.1*样重

游离Proline 含量测定采用    方法
配制：
磷酸（6M）
3%磺基水杨酸
2.5%酸性茚三酮 (冰乙酸：磷酸（6M）= 3 ：2，称重，按2.5%再加茚三酮)

取0.2 g叶片，剪碎(0.2cm)放至试管，加5.0ml 3.0%磺基水杨酸，沸水浴10 min（浸提）；吸2.0 ml浸提液至试管（25 ml试管），加2 ml蒸馏水、2 ml 冰乙酸，再加4 ml 2.5%酸性茚三酮，沸水浴60 min(反应)；冷却，加入4 ml甲苯，充分涡旋振荡，吸取甲苯层，测OD520；由Proline标准曲线求得样品Proline含量。
浓度=OD*22.4215-0.007489

叶绿素含量测定
取鲜样0.1克放于试管，加10毫升溶液，密封，放于黑暗处培养六-八个小时，不超过十二小时，然后于663nm/645nm处比色，得OD值。
溶液配置：丙酮：乙醇（无水）=1：1。
计算：Ca=12.7D663-2.69D645

Cb=22.9D645-4.58D663

C=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663

[ Last edited by dhd997 on 2010-12-18 at 13:52 ]

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