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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR没有条带
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napzy

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】PCR没有条带 已有8人参与

大家好，我是个刚做分子的新人，PCR有些还不太明白，请教大家。
最近我跑PCR，两对引物，第一对，一跑就出了目标条带，第二对跑了很多次，死活跑不出东西来。大家帮我分析下，问题可能出在哪里？
引物设计没问题，很多人都用这对引物。我按照文献的各种方法都跑了，渐变温的，恒温的。开始怀疑引物出问题了，放了很长时间了，但这两天又用新配的引物也还是跑不出来。我也试着改变DNA模板浓度跑了，也没跑出任何东西来。
老板告诉我的信息是，肯定能跑出来，我们试验室毕业了的人跑过，再就是确实不好跑出来，第一对引物比较好跑出来，第一对跑出来了但第二对引物不一定能跑出来。他的意思是不是DNA模板可能有问题？纯度不够？
大家帮我分析下，我的实验过程中可能哪些地方出了问题，该怎么解决这些问题，谢谢了！

这是第一对引物跑的图

这是第二对引物跑的，跑出应该是同第一对的差不多，都应该是300多bp的片段
（另外弱弱的问一下，最下面那条带是什么？引物？引物二聚体？）
谢谢大家了！

[ Last edited by napzy on 2010-12-16 at 18:49 ]
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1楼 2010-12-16 18:47:55
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napzy

新虫 (初入文坛)
谢谢大家了。
我是用的1%琼脂糖检测的。第二张图片黑的那里是溴酚蓝，应该是我照的时候没调好吧。没有洗胶，电泳完直接紫外检测。
因为我的试验，第一对检测可能有假阳性情况，需要两种检测的结果相综合。
PCR程序我是参考别人文献报道的跑同样的材料，同样的引物的程序，几种都跑了，跑不出来后我还试着调整程序跑了，也是没结果。
不行再全部重头来一次，所有的试剂，包括水什么的都尽量用新的试试看吧。
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7楼2010-12-17 19:48:25
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查看全部 9 个回答

starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第二幅图里下面的应该是引物二聚体
赞一下(1人) 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2010-12-16 19:02:33
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-12-16 20:27:23
最下面的是引物二聚体
有一对引物能跑出来能用不就行了吗 。。。。。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-12-16 19:07:06
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lovenlong

铜虫 (小有名气)

停下了，好好总结再做看看。

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by napzy at 2010-12-16 18:47:55:
大家好，我是个刚做分子的新人，PCR有些还不太明白，请教大家。
最近我跑PCR，两对引物，第一对，一跑就出了目标条带，第二对跑了很多次，死活跑不出东西来。大家帮我分析下，问题可能出在哪里？
引物设计没问题 ...

弱弱地问下：你第二个图那些黑斑是啥？洗完胶就这样还是咋滴？
如果你用的引物是新的，DNA能跑出第一对那也是没问题的，PCR体系也一样，那退火温度你设的多少？扩增的目的片段GC含量比例是否很高？很可能是加错东西哦。。。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-12-16 20:25:25
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