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蛋白质提取、纯化及分析技术等十八个试验
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实验一 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、原理与目的 多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。 本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。 二、材料与试剂 （1）马铃薯（大约每小组100-200g） （2）试剂： 0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配 （3）实验器械与仪器设备： 试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋； 过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机； DL-7A大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤 1：粗酶提取： 水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。 2：盐析分级沉淀： 在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。 四、实验结果 获得PPO粗酶液。 实验二 PPO粗酶液的纯化 一、原理 1.葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析 利用大分子不能进入凝胶颗粒内部 最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质） 2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。粗酶液从而得到纯化。 二、材料与试剂 试剂：0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200;兰葡萄糖－40、70、100等； 实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤 1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 （1）柱材处理 称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。 （2）装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 （3）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。 2．上样：将粗酶液上柱。 3．洗脱：用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。 4．DEAE－纤维素的处理及装柱 （1）处理 本实验采用的是DEAE－纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。 （2）装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 （3）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。 5．上样： 将洗脱酶液上样，用0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。 6．洗脱： 用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)进行梯度洗脱。 7．测定酶活性和蛋白质浓度 实验三 PPO活性测定 一、原理与方法 PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。 二、仪器与试剂 （1）样品： 多酚氧化酶粗酶液 硫酸铵沉淀组分 DE-52洗脱组分 葡聚糖凝胶洗脱组分 （2）底物： 邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液 （3）反应体系： 0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8 （4）器皿与仪器： 试管、恒温水浴等 分光光度计 三、酶蛋白的比活性 比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质 四、实验结果与分析 1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410） 结果列表 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 空白 0 0 3 0.16 0.09 粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03 1 0.00 0.01 5 0.03 0.01 2 0.13 0.09 6 0.02 0.02 分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。 2. DE-52的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410） 结果列表 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 空白 0 0 3 0.03 0.05 粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05 1 0.00 0.00 5 0.07 0.02 2 0.03 0.02 6 0.03 0.00 分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。 实验四 胰酶分离提取 一、原理与目的 提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。 胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活；低与此PH酶易变性；高于PH5时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000－25000，而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中，酶原N端Lys与Ile之间的 一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI变成10.8。 本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。 二、材料与试剂 1．仪器 紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH试纸，滤纸、玻璃器皿等。 2．材料：新鲜猪胰脏 3．试剂及溶液配制 pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。 0.8M pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M四硼酸钠溶液，混合后用PH计校正。 三、操作步骤 1．胰蛋白酶原的提取与分离： （1）称取1－1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏（或用高速组织匀浆机捣碎）加1－2倍体积以预冷却的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取（按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推）。检查提取液中PH，若高于PH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持PH2.5－3.0之间。在冷室5℃左右搅拌提取18－24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlpH2.5乙酸酸化水再提取残渣一次（时间约为1－2h），合并滤液，此时滤液PH值较高，可用5M H2PO4溶液调整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物。 (2)盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75％饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品。 （3）胰蛋白酶原得激活：将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量（约为滤饼重得1/4）。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体CaCL2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调PH至8.0。在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5℃冰箱中使酶原活化。 （4）纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液PH至2.5－3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40％饱和度（每升滤液加242g硫酸铵）。放置5℃冰箱中5－8h,抽滤除去沉淀。 实验五 卵清蛋白分离提取 一、实验目的与原理 鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。 由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。 二、材料与试剂： 1．材料：新鲜鸡蛋2只 2：仪器：抽滤瓶500－1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂： 10％TCA，用固体NaOH调调PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液 三、操作步骤 1，取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25℃－30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4℃冰箱中放置过夜。 2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。 3，边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。 4，将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。 实验六 亲和层析纯化胰酶 一、实验目的与原理 生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相的时候，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。 本实验通过将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。 二、仪器与试剂 1.鸡卵粘蛋白制备 2．Sephadex-G75的活化和偶联 2．5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水） 3．亲和层析 0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml 仪器器材：抽滤瓶500－1000ml、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器 三、操作步骤 1、鸡卵粘蛋白的制备 2、Sephadex-G75的活化及偶联 2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用，活化凝胶，纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝胶，75％K2CO3，调pH7.5-9.0,缓慢搅拌3h。反应过程随时加入5％K2CO3,以维持pH的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5，洗涤。 3、胰蛋白酶的亲和层析 卵类粘蛋白在pH7－8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH2－3时又能解离，因而掌握好上柱地PH条件和洗脱缓冲条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白地粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合地杂蛋白后，改变PH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化地目的。由于亲和层析结合地专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。 (1)亲和层析 将鸡卵粘蛋白－Sephadex-G75装柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2－3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm处检测蛋白质吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1N的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析，柱的流速维持在1.5ml/min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。 当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。 （2）胰酶蛋白和活性测定 |
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实验七 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定 一、实验目的与原理 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。 本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。 二、仪器与试剂 1．材料： 硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。 2．试剂： （1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis） （2）10％的SDS溶液 （3）10％的过硫酸铵溶液 （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）分离胶缓冲液：1.5M Tris,PH8.8 （6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris,PH6.8 （7）电极缓冲液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3 （8）样品缓冲液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰 （9）染色液：0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液 （10）脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液 （11）标准分子量蛋白。 3．仪器设备： 电泳仪，垂直电泳槽等。 三、操作步骤 1, 凝胶制备： 用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。 2, 上样： 分别取样品若干ml于离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2－3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1－2cm时，即可停止电泳。 3, 染色： 电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），如果比例不当，就不能得到准确的数据。 2、 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。 3、 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 4、 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 5、 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。 实验八 Western bloting 技术 一、实验目的与原理 Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下的其他蛋白结合位点封闭，加入与检测蛋白特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗与靶蛋白结合，经洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合抗体。在加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白—一抗—二抗的位置即将呈现一定的颜色。 二、材料与方法 1.材料 从微生物细胞中提取的多酚氧化酶（PPO）：10μl，20μl NC膜：硝酸纤维素膜 2.仪器： 电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床 3.试剂： 转移缓冲液：48Mm Tris,39mM甘氨酸，0.037%SDS同时加入20%乙醇。 封闭液与稀释液：PBS（牛血清白蛋白） 辣根过氧化物酶显色液：现配现用 三、操作步骤 1.SDS-PAGE电泳见上个实验 2.电转 ⑴剪NC膜大小、滤纸与凝胶板一致，浸泡在转移缓冲液中5min。 ⑵在转移装置中依次将三层滤纸、凝胶、滤纸、三层滤纸放在一起。 ⑶将装好的转移装置放入电转移槽中NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极。 ⑷接通电源电压63V，电流90mA,转移过夜。 ⑸转移结束后，取出装置，依次取掉各层，用铅笔在膜的上沿做标记，切下其中一个孔所对应膜的一半。 ⑹NC膜的封闭：将NC膜放入一塑料袋中，加入封闭液3ml，封口，轻轻震荡2h。 ⑺将封闭好的NC膜放入另一塑料袋中，加入用封闭液稀释的一抗，2.8ml，封口。4℃下轻摇2h。 ⑻洗膜：弃去反应液，用一抗稀释液洗三次，每次10min。 将膜从PBS中取出转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min。 ⑼将二抗用二抗稀释液稀释，将NC膜放入塑料袋中，加入二抗溶液2.8ml。封口，轻轻震荡1h。 ⑽洗膜：取出膜转至150mM氯化钠，50mM Tris-HCL(pH7.5)溶液中轻轻震荡10min，三次。 ⑾将膜放入显色液中，室温轻轻摇动，10min。 ⑿待条带出现后，立刻用水洗膜，然后转入PBS中，观察记录。 实验九 等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点 一、原理 等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”. 二、仪器与试剂 1．材料：蛋白样品 2．试剂： 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100 电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液） 固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。 脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水 样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素 三、操作步骤： 1, 样品制备： 用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。 2,制模具： 洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。 3, 配胶： 胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1） 6－8％尿素 1ml Ampholine (pH3.5-10) 60-80ul 10%AP 5 ul TEMED 4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具 5, 电泳： 等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。 6, 表面电极测定蛋白质的pI 7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min 8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现 9, 可脱色至背景消除后干燥保存。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、 过硫酸铵一定要新配置。 4、 所有水用重蒸水。 5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。 核酸技术 实验十 染色体DNA的提取 一、实验目的与原理 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。 二、材料以方法 1、 材料：培养菌体 2、 仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、 试剂： 细胞裂解液 100 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 500 mM NaCl 1.25% SDS PH 7.5 饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇 无水乙醇，70％乙醇，异丙醇 3 M NaAc pH5.2, RNase，50×TE缓冲液，电泳载样缓冲液 三、操作步骤 （1） 培养菌体 （2） 加入10 ml裂解液，1/10体积酚，于65℃下20－30 min，然后加入等体积的氯仿，轻摇 （3） 12000－15000rpm离心15 min （4） 取上淸液，加入等体积氯仿，轻摇，12000－15000rpm离心15 min （5） 取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃） （6） 加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2)，置于室温下10 min （7） 12000－15000rpm离心10 min （8） 倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀 （9） 加入2倍体积无水乙醇 （10） 12000－15000rpm离心10 min （11） 倒弃液体留下沉淀，真空干燥 （12） 复溶于2 ml TE （13） 加入RNase，65℃或37℃处理10－30 min （14） 加等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm离心10 min （15） 取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃） （16） 加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2)，置于室温下10 min （17） 12000－15000rpm离心10 min （18） 倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀 （19） 真空干燥沉淀 （20） 复溶于0.5－1.0 ml的TE或水中，分装成小体积，4℃或-20℃保存。 （21） 电泳检测提取DNA的质量 四、结果与分析 点样空，若发亮则说明有污染 超螺旋结构DNA，若条带有拖尾则 说明有破碎的DNA 少量未清除的RNA 五、注意事项 1、 重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。 2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水，以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解，后面还需去离子。 3、 取上清时，如果上清液过少，可再加入少量水，重新离心，取上清，避免DNA损失过多。 实验十一 质粒DNA的提取与纯化 一、实验目的与原理 质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。 二、材料与试剂 1、材料：大肠杆菌 2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪 3、试剂： Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4) 10 mM EDTA(pH8.0) 50 mM葡萄糖 高压灭菌，4℃保存 Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用 Solution III 5 N KAc pH4.8 高压灭菌，4℃保存 3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂 三、操作步骤 1、细菌繁殖 LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜 2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液 3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃ 加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min 4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min 5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min 6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃ 7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min 8、离心10 min，12000 rpm, 4℃ 9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中 10、加入40 ul，3 M NaAc 11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀 12、离心10 min，12000 rpm, 4℃ 13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。 14、电泳检测提取DNA的质量 三、结果与分析 超螺旋结构DNA 四、注意事项 在本实验中，如果不经过RNase处理，在电泳带中，RNA会呈现极亮的带，所以，建议使用RNase处理一下。离心时应注意转速不能太低，太低会导致质粒不纯；也不要太高，否则质粒不易溶解。电泳时应注意电压，电压太高或混有蛋白质杂质时电泳带容易产生偏离和拖尾。在DNA操作中应尽可能轻地操作（尤其是分别加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ轻轻摇），否则质粒容易断裂，从而在观察条带时出现许多杂带。无水乙醇可用于沉淀质粒，如果质粒量比较大的话，一般用异丙醇来沉淀。 实验十二 亚克隆技术 一、目的与原理 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。实验主要通过EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ两种限制性内切酶对λ DNA的单切酶、双切酶及部分酶切的操作，掌握内切酶的实验操作技术。 二、材料与试剂 1．材料：λDNA 2．仪器： 离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪 3．试剂 EcoRI及缓冲液，HindIII及缓冲液，λDNA,TAE缓冲液 三、操作步骤： EcoRI、HindIII单酶切及部分酶切 取2只干净、灭菌新Eppendorf管，分别按下表加入 试剂 A（μl） 灭菌水 0 10×缓冲液 2 质粒 5 染色体DNA 12 EcoR I 1 HindIII 0 总体积 20 37℃保温1—2小时。保温结束后，分别加入0.5M（pH8.0）EDTA（使终浓度达到10mM）。加入6μl电泳加样缓冲液。 电泳。 EcoRI、HindIII双酶切 取1只干净、灭菌新Eppendorf管，按下表 加入试剂 体积（μl） 灭菌水 14 10×缓冲液 2 λDNA 2 EcoR I 1 HindIII 1 总体积 20 37℃保温1—2小时。保温结束后，分别加入0.5M（ pH7.2）EDTA（使终浓度达到10mM）。加入6μl电泳加样缓冲液。电泳分析。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 酶的量不超过总体积的1﹪，以为酶的保存液中含有甘油，甘油太多会形成星活性，切下非目的片段。 2、 在加入模板DNA以前可加入少量BSA，减轻管壁对酶的吸附作用。 3、 如果用双酶切，必须注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可以用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，随着调节盐浓度，再用高盐浓度的限制酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿（1：1）抽提，加0.1倍体积的3mol/LnaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置30分钟，离心，干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 |
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实验十三 DNA片段的连接技术 一、目的与原理 DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。 二、材料和方法 1． 仪器 离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器 2． 试剂 T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚，TE缓冲液，电泳缓冲液、3M NaAc 三、操作步骤 取干净、灭菌新Eppendorf管，按下表加入各试液 试液 体积（μl） T4DNA连接酶缓冲液 1.5 λDNA 10 ATP 1 无菌水 1.5 连接酶 1 总体积 15 19--20℃ 保温2小时，提取已连接好的DNA片段。电泳分析。 四、结果 （略） 五、注意事项 1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃，但该温度下DNA退火效率低，连接效率还不如22℃高。 2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。 实验十四 受体菌感受态细胞的制备 一、目的与原理 当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。 二、材料和方法 1． 材料：大肠杆菌 2． 仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜 3． 试剂 LB培养基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高钴 TFB：10Mm MES（pH6.3） 45Mm MnCl2 10Mm CaCl2 10Mm KCl 三、操作步骤 大肠杆菌在LB培养基平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。取1ml培养物7000rpm，离心3min，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙（或TFB），放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储于-70℃保存。 四、结果 （略） 五、注意事项 一般地，新制备的感受态细胞48h后转化效率降低，15d后失效。因此，感受态细胞不能保存太久，4℃保存一周，但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔，损伤感受态细胞。 实验十五 重组片段的转化及克隆和筛选 一、目的与原理 转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。 二、材料和方法 1.材料：大肠杆菌 2.仪器： 离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜 3.试剂 LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ; TFB：10mM MES（pH 6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl 三、操作步骤 1. 感受态细胞融化（在手心） 2. 加入溶于TE的待转化外源DNA，冰浴30min。 3. 42℃热冲击2 min。 4. 冰上2min。 5. 加入0.4 ml LB液体培养基，37℃保温摇床45 min 6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上，37℃培养。 四、实验结果及分析： 培养皿上有白色菌落和兰 色菌落，但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色，所以白色菌落说明转化成功；兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接，若是在原酶切位点的连接进行的转化，菌落为白色；若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化，菌落为兰色（说明在酶切上成功，连接上也成功，转化上也成功）。 五、注意事项 关键要严格控制热激时间，超过2min，则转化会失败。 免疫学实验 实验十六 单向琼脂扩散实验 一、原理 单向琼脂扩散实验又称单向免疫扩散实验。指可溶性抗原在相应抗体的琼脂介质中的扩散，可定性、定量抗原。 二、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。 2.取15ml琼脂糖加到56℃预热玻璃管中，加入约200微升抗血清，充分混匀后铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。 3.待凝胶凝固后打孔，直径为3㎜，将孔内琼脂弄出。 4.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔内，每孔5微升。 将凝胶板置于湿盒内，室温过夜，观察结果。 三、实验结果 发现沉淀环的大小与抗原的浓度成反比，基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关，而且和琼脂中抗体的浓度有关。 实验十七 双向琼脂扩散实验 一、原理 双向琼脂扩散实验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀。 二、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。 2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。 3.打孔，孔距为4㎜， 4.将抗血清按二倍稀释法稀释成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同浓度。 在周围孔中加入不同浓度的抗体，中心孔加抗原。 将凝胶板置于湿盒内，室温过夜，观察结果 三、实验结果 浓度不同，形成不同的沉淀的线。 实验十八 免疫电泳 一、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56℃水浴中保温。 2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。凝固后，打孔。 3.在孔内加入抗原，其中一孔内加电泳指示剂。 4.将凝胶板放在电泳槽中进行电泳，确定电泳时间。 5.电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖2㎜宽的长槽，加入抗血清。 二、实验结果 将凝胶板放入湿盒，室温放置12小时，可观察在到沉淀弧线。 实验十九 对流免疫电泳 一、操作步骤 1．1％琼脂糖融化后，置于56℃备用。 2．取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，凉干。 3．将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。凝固后，打孔。 4．在孔内分别加入抗原和抗体，每孔5微升，抗体点阳极，抗原点阴极。 5．在电场中电泳50min，5V。 二、实验结果 在小孔中间出现沉淀线。 实验二十 火箭免疫电泳 一、操作步骤 1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台。 3％琼脂糖融化后，置于56℃备用。 2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。凝固后，打孔。 3.将抗原按倍比稀释，在孔内分别加入标准抗原和代测样品，每孔5微升。 在10V电场中电泳3小时。 二、实验结果 发现在电泳方向上有拖尾，拖尾长度与抗原浓度有关。 |
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