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M3的分子生物学一
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白血病的发生是由于造血细胞增殖能力提高、分化阻滞、凋亡障碍，不同类型的白血病非随机性染色体异常形成的融合基因在白血病发生中起着重要的作用。认识理解这些融合基因如何改变了造血细胞的增殖、分化与凋亡，就可以明确白血病的发生机理，并可以针对这些致病分子设计研究新的抗白血病药物。 急性早幼粒细胞白血病（APL， acute promyelocytic leukemia） APL最为常见的染色体易位为t（15；17）（q22；q21），阳性率约占98％，其它几种少见的染色体易位有t（11；17）（q23；q21），t（5；17）（q35；q21），t（11；17）（q13；q21）。这四种染色体异常所累及的基因以及形成的融合基因均已被克隆，对其功能也有了较深刻的认识。这四种异常均累及到维甲酸受体α（RARα, Retinoic acid receptorα）。 (一) t（15；17）（q23；q21）与PML-RARα 1977年Rowley发现在APL中存在有t（15；17），1990年法国学者de The发现t（15；17）造成RARα基因重排。1992年de The及美国的Evans所领导的研究人员几乎同时报道了t（15；17）造成早幼粒细胞白血病基因（PML，promyelocytic leukemia,）与RARα重排，形成PML- RARα融合基因。 1．PML基因 结构 位于常染色体15q22上，基因组长度约为35Kb,含有9个外显子，转录剪切后产生多种不同大小的mRNA，主要的几种mRNA长度为4.6、3.0和2.1Kb，最长的mRNA编码560氨基酸（aa，Amino acid）的蛋白，分子量为70KD。PML蛋白从其结构特点上可划分为几个重要的结构域。①氨基末端脯氨酸富集区，位于第1－46aa。②半胱氨酸富集区，位于第57－222aa，这个区域中含有3个锌指结构，第一个称为Ring（Really Interested New Gene）指，其余2个称之为B盒锌指。Ring指、B盒锌指使PML定位于核小体中。③螺旋盘状结构：位于第229－360,含有8个重复序列，每个序列含7个氨基酸，其中第1和第4位氨基酸是疏水性的。这一区域参与PML多聚体的形成，并可与PML-RARα形成异二聚体及核小体的定位。④核定位信号（NLS，Nuclear localization signal），位于第476－490aa。由于NLS的存在，使得PML蛋白定位于细胞核内。而PML定位于核小体内还需要Ring指，B盒指及螺旋盘状基序的参与。⑤C末端丝氨酸/脯氨酸富集区，功能不明确，可能为磷酸化位点。 表达 由于采用的技术与方法问题，对PML在组织中的表达的认识较为复杂，存有争议。骨髓髓系祖细胞中PML表达较高，外周血单个核细胞及成熟粒细胞中表达较低。有丝分裂后成熟的T、B淋巴细胞有表达，而生发中心及胸腺皮质细胞中无表达。 PML与核小体 应用PML蛋白的抗体进行细胞免疫荧光染色，发现PML在细胞核内呈现分散的斑点状分布，这是PML蛋白主要特征之一。这种斑点状结构称之为PODs（PML oncogenic domains）或核小体。核小体是由多种相互结合作用的蛋白所组成。在不同细胞类型中其大小、数量均有不同（一般每个细胞有10～20个），直径0.3～0.5um。在t（15；17）APL细胞中，PML蛋白自核小体中离出，而经维甲酸治疗后又重新定位于核小体中。PML表达的强度及分布形式随细胞周期的进程而有改变，G0期细胞核小体数目少，PML染色弱，细胞受刺激进入细胞周期以后，PML表达增高，核小体数目增加，细胞从S期到G2期，PML先分散为多个细点，表达逐渐减弱。核小体是否参与转录调节目前存有争议。 PML对转录调节的作用 体外转录分析的间接研究发现，PML抑制多药耐药基因（MDR ，Multi drug resistant）和表皮生长因子受体的转录，但是增强CD18、主要组织相容性复合物转运分子TAP-1的转录。在黄体酮刺激下，PML可以显著提高黄体酮受体（PR，Progestrone Receptor,）的激活转录能力，PML对PR的刺激活性位于其半胱氨酸富集区与螺旋盘状结构。可能的机制是PML增强了PR对DNA的结合能力，或是竞争结合了PR的阴性调节分子。PML对转录调节的作用，目前的研究结果存在不同的看法。PML本身不具有DNA结合能力，以上所述的PML对转录调节的作用均是间接性。如果将一般的DNA结合多肽GAL4DNA结合域与PML构成融合蛋白，使用含GAL4结合序列的报道基因，则发现PML呈现转录抑制作用，其抑制活性区域位于螺旋盘状结构和C末端丝氨酸富集区。 PML抑制细胞生长、转化 HeLa、CHO和NIH/3T3细胞系中稳定表达PML，生长速率可以 降低2～5倍，干扰素可以协同PML对细胞生长的抑制作用，PML中的Ring指和螺旋盘状结构介导了这一抑制效应。在表达Ha-ras与突变p53，或Ha-ras与c-myc的大鼠胚胎纤维母细胞中转染PML可以抑制细胞的恶性转化。PML可以使转化的NIH/3T3细胞恢复正常形态与生长接触抑制，抑制转化灶形成。PML还可促进细胞凋亡，应用PML反义寡核苷酸处理的细胞，当血清撤除后可以延迟凋亡。PML基因敲除的纯合子小鼠（PML-/-），r射线照射及Fas抗体诱导的T细胞及骨髓细胞凋亡数目显著减少，而且Caspase-1和Caspase-3激活明显减低。PML小鼠胚胎纤维母细胞高表达PML，可引起Caspase非依赖性细胞凋亡，PML可以将死亡效应分子Bax和细胞周期素激酶抑制子p27KIP1带入到核小体中。以上表明PML可以促进细胞凋亡，并提示高水平PML引起凋亡是Caspase非依赖性，而低水平PML所致凋亡是Caspase 依赖性。化学致癌剂DMBA处理后，PML-/-小鼠皮肤乳头状瘤及淋巴瘤的发生率升高2倍。除APL外，常无PML重排、突变失活的报道。因此，目前尚不能断定PML是一种抑癌基因。PML上述生物学活性均依赖于正常的核小体结构。 2．维甲酸受体RARa 结构 RARa蛋白是一种核受体，从其结构上均可以划分为6个区域，从氨基端到羧基端分别以A到F命名。AB区是转录激活区。C区是核受体及维甲酸受体中最为保守的区域，含有由2个C2C2半胱氨酸锌指组成。D区是铰链区，负责RARa空间构像的变化。E区含有配体结合部位、转录激活区（AF-2），并可与其它转录调节分子结合。F区功能不明。 RARa调节转录的作用 RARa 通过DNA结合域及配体结合区与视黄醛受体（RXR，retinoid X receptor）形成异二聚体，通过锌指基序与许多基因启动子中的维甲酸反应元件（RAREs ，Retinoic acid response elements,）结合。维甲酸受体家族的RAREs是由2个（A/G）G（G/T）TCA重复序列组成，其间间隔2～5个核苷酸，RARa的RAREs间隔5个核苷酸。 ①靶基因：正是由于许多种基因的启动子中含有RAREs，RARa可以与其结合而调控这些基因的表达，这些基因也就是RARa的靶基因，见表1。这些基因种类繁多，可以看出RARa的生理作用广泛，可以促进粒细胞分化成熟。当PML-RARa形成后，以显著负性作用抑制粒细胞分化停滞在早幼粒细胞阶段，而导致APL的发生。 表1. 类 别 基 因 细胞周期调节因子 细胞周期素，细胞周期素依赖性激酶（CDK）、 CDK抑制因子 细胞表面黏附分子 CD11b、CD18 防御分子 单核细胞趋化因子、白细胞介素 中性粒细胞颗粒蛋白 防御素、次级颗粒蛋白、碱性磷酸酶、乳铁蛋白 集落刺激因子及受体 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、G-CSF受体、单核细胞集落刺激因子（M-CSF）受体 细胞凋亡及终末分裂调节分子 转谷氨酰胺酶II、Bcl2 凝血因子 血栓调节素、组织因子、尿激酶、组织纤溶酶原激活物及刺激因子 转录调节因子 RARs、STATs、Hox基因（同源异形基因） ②转录调节作用：RARa结合到DNA靶序列后，通过与其它分子直接或间接结合而起到调节转录的作用。在RARa不结合配体时，其配体结合区与核受体辅助抑制因子（N-CoR ，nuclear receptor co-represor,）、视黄醛和甲状腺素受体家族静止介导因子（SMRT，silencing mediator of retinoid and thyroid）结合，再与mSin3/组蛋白脱乙酰化酶（HDAC， histone deacetylase，）结合，HDAC使得组蛋白的赖氨酸脱去带负电荷的乙酰基，这样组蛋白与组蛋白间及组蛋白与DNA间的结合变得紧密，转录因子难以结合DNA，而不能起始转录，呈现转录抑制。当RARa结合配体后，配体结合区构象发生改变，不仅可以将配体锁在一个袋装结构中，而且能将其变为疏水性，这样就与SMRT、N-CoR/mSin3/HDAC解离，转而与大的多分子复合物结合。这个复合物中包括TIFI、p300、CREB结合蛋白（CBP，CREB binding protein）、CBP结合因子（CBP associated factor, pCAF）,P/CIP（p300/CBP cointegrator associated protein）,NCoA-1（nuclear coactivator-1,也称之为SRC-1，steroid receptor coactivator-1），NCoA-2（nuclear coactivator-2，也称之为TIF-2，transcription initiation factor 2）。在这其中，p300、CBP、pCAF、NcoA-1、NcoA-2、pCIP均具有乙酰基转移酶的作用，使组蛋白H2B、H3、H4赖氨酸乙酰化，这样带负电荷的组蛋白之间及组蛋白与DNA间的结构疏散，转录因子容易结合DNA，而使转录起始，表现出转录激活。由此，可以看出RARa对靶基因转录的调节是双重性的。不结合配体时，抑制转录，结合配体后变成激活转录。 3.PML-RARa 结构 t（15；17）染色体易位造成PML、RARa的重排。RARa的断裂区域单一，位于第2内含子，而PML的断裂点主要有3个，形成的PML-RARa融合基因转录本及其编码的蛋白大小也就不同。PML5’端断裂点，也称之为bcr3（breakpoint cluster region 3）, 位于其第3内含子，PML-RARa融合基因转录剪切后，PML的1～3外显子与RARa融合，形成短型PML-RARa（PML（s）-RARa）转录本，编码的蛋白包含PML的Ring指、B盒、盘状结构区和RARa的B-F区。PML3’端断裂点，bcr1，在第6内含子，这样PML的1～6外显子与RARa形成长型PML-RARa（PML（L）-RARa），融合蛋白中包含了PML的Ring指、B盒、盘状结构区、核定位信号和部分丝氨酸、脯氨酸富集区与RARa的B-F区。PML的5’与3’断裂点之间还有一个断裂点bcr2，位于第6外显子上，这样PML的1～5外显子、部分第6外显子与RARa形成变异型PML-RARa（PML（v）-RARa），蛋白结构类同PML（L）-RARa。在APL中，70％病例带有PML（L）-RARa，短型及变异型分别占20％与10％。PML-RARa在APL细胞中表达水平高出野生型RARa。 PML-RARa融合蛋白的调节转录活性 PML的盘状结构介导了PML-RARa/PML-RARa同二聚体、PML-RARa/PML异二聚体的形成。另外，通过RARa的E区，PML-RARa与RARa竞争结合RXR形成异二聚体。PML-RARa同二聚体及PML-RARa/RXR均可与正常的RXR/RARa竞争结合RAREs，并且处于优势地位。 在无维甲酸刺激下，PML-RARa抑制转录的程度大于RARa，PML-RARa结合SMRT、N-CoR的能力明显强于RARa。生理水平的全反式维甲酸（ATRA， all-trans retinoic acid）（10-9mol/L）可以使RXR/RARa与SMRT、N-CoR解离，而PML-RARa仍能与两者结合，并以两者为桥梁与HDAC结合，阻断髓细胞分化的某些关键基因的表达。而在药理剂量水平ATRA刺激下（10－6mol/L），PML-RARa可与SMRT、N-CoR解离，而与辅助激活因子结合，诱导髓细胞分化基因的表达和APL细胞的分化。PML-RARa结合RXR能力较强，因此，可以抑制其它核受体的转录激活作用。PML-RARa可以阻断维生素D受体（VDR ，vitamin D receptor）/RXR的形成，阻断了维生素D3介导的转录激活作用，过量表达RXR，可以逆转PML-RARa的抑制作用。PML-RARa还影响了髓细胞分化的其它转录调节途径。例如，ATRA和RARa可以抑制AP1（Fos/Jun）蛋白转录激活的作用，可能与RARa与AP1竞争有限的辅助激活因子所致。然而ATRA 和PML-RARa可以增强AP1的转录激活作用。RARa和STAT1a可以协同刺激含干扰素反应元件报道基因的转录，而PML-RARa无此效应，提示APL中干扰素和维甲酸间的信号联系有缺陷。 PML-RARa与核小体 在APL细胞中，通过PML的螺旋盘状结构，PML-RARa与PML形成异二聚体，正常的核小体遭到破坏，形成的100个0.1um大的微斑。同时，PML-RARa还将Sp100、PLZF、RXR、Rb等其它核蛋白带入到微斑中。这样，PML抑制细胞生长，促进凋亡的功能便会丧失。 抑制分化、凋亡 PML-RARa转染U937细胞后，可以在低血清浓度的培养基中增殖，而对照细胞发生凋亡。PML-RARa可以下调肿瘤坏死因子（TNFa， tumor necrosis factor a）受体，阻断TNFa诱导的凋亡。由于APL细胞表达分泌高水平的TNFa，这样可以使得APL细胞逃避自身生长抑制作用。 G-CSF依赖性TF-1细胞系，在G-CSF撤除之后发生细胞凋亡，而转染表达PML－RARa之后，可以阻止凋亡的发生。应用核酶的方法消除APL细胞系NB4中PML-RARa的表达，可以诱导其分化。 PML-RARa在APL的发病中的作用机制模型 显著负性作用抑制野生型RARa的功能。生理水平的ATRA（10-9～10-8）结合RARa后可以激活RARa的靶基因，引起髓细胞的分化，由于PML-RARa表达水平高于RARa，与RARa竞争结合RAREs和RXR中处于优势。这样PML-RARa以同二聚体或PML-RARa/RXR异二聚体结合到RAREs上，由于PML-RARa与N-CoR/mSin3/HDAC转录抑制复合物亲和力高，生理水平ATRA不足以使PML-RARa与复合物解离，RARa的靶基因处于转录的关闭状态，髓细胞分化受阻。 显著负性作用抑制PML功能。PML-RARa可以与PML消除异二聚体，使PML离开正常的生理定位，核小体破坏，PML抑制细胞生长，促进定位的功效丧失。 |
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4.APL的疗效原理 ATRA ①PML-RARa的降解。ATRA通过诱导Caspase-3样活性，可以降解PML-RARa。切割位点位于螺旋盘状结构的羧基端。降解后的PML-RARa几乎失去全部的PML部分，不能与PML形成异二聚体，使得PML重新回到核小体中，发挥其正常功能。另外，PML-RARa切割后功能类似于RARa，可以激活RARa的靶基因。值得注意的是，PML（s）-RARα不含有Caspase切割所识别的序列，因此，ATRA治疗后不发生降解。而且，PML（L）-RARα的降解也非全部能够被降解。所以，ATRA治疗APL细胞虽发生凋亡，但不如As2O3那样显著。 ② RARa靶基因的激活。药理剂量水平的ATRA（10-6mol/L）可以使PML-RARa与N-CoR/mSin3/HDAC解离，而与CBP、p300、pCAF、NCoA-1、 NCoA-2等结合，而导致RARa靶基因的激活，APL细胞分化。PML- RARa中的RARa配体结合部位突变，不能结合ATRA，RARa的靶基因不能被激活，可以导致ATRA的耐药性。 三氧化二砷 三氧化二砷（As2O3， arsenic trioxide）可以提高PML自核浆转移至核基质的速率，同时PML将死亡效应分子带入核小体中，核小体结构迅速恢复。PML-RARa进入到核小体中，然后被完全降解。对ATRA耐药的APL细胞，As2O3也具有同样的作用。 丁酸 丁酸治疗APL已有成功病例的报道。一例APL经ATRA治疗缓解后复发，又经As2O3诱导治疗后再次复发，经用丁酸治疗取得完全缓解，经RT-PCR检测，PML- RARa的RNA转阴，现缓解持续已半年以上。如前所述，PML- RARa与N-CoR/mSin3/HDAC结合，引起RARa靶基因转录抑制，丁酸是HDAC的抑制剂，可以消除PML- RARa抑制基因转录的效应，RARa靶基因的转录被激活。 (二)、t（11；17）（q23;q21）与PLZF-RARa 1. PLZF基因 t（11；17）在APL中十分少见，仅占APL的0.5％，1993年我国陈竺实验室克隆11号染色体所累及的基因，命名为早幼粒细胞白血病锌指基因（PLZF，Promyelocytic Leukemia Zinc Finger）。PLZF的基因组结构目前尚不十分明确，其mRNA为7kb左右，编码673aa的蛋白，分子量为74KD。PLZF在细胞核内表达，部分定位于核小体内。 结构 ①POZ（Pox virus and Zinc finger）/BTB（Broad complex, tramtrack, Bric a Brac）结构域，由氨基端118个氨基酸构成，此区介导了同/异二聚体形成和生长抑制，与N-CoR/mSin3/HDAC结合，而引起转录抑制。 ②锌指结构：由9个krüppel样C2H2锌指构成，可以与DNA结合，结合序列为GT（A/T）（A/C）AGT前2个锌指可以与PML结合，后7个锌指与DNA结合， PLZF在髓系早期祖细胞表达，随着细胞分化表达逐渐减低。阻断或降低PLZF的表达，BFU-E、CFU-GM的表达数目减少。提示，PLZF在维持造血干细胞或者早期祖细胞生存方面可能发挥重要作用。 对转录的调节 PLZF的锌指结构与DNA结合，而POZ/BTB与SMRT，N-CoR/mSin3/HDAC结合。如果将PLZF结合的DNA序列连接到报道基因上，PLZF可以抑制报道基因的转录。在同源异形盒基因hoxb和细胞周期素A的启动子中，存在PLZF的结合序列，PLZF可以抑制两者的转录。 抑制细胞生长 细胞周期由G1期进展到S期是由细胞周期素A和细胞周期素依赖性激酶2（CDK2，cyclin dependent kinase 2）介导的磷酸化所控制。PLZF抑制细胞周期素A的转录，下调其表达。当PLZF转染白细胞介素3（IL-3）依赖性小鼠髓系细胞系32D后，细胞阻止在G1期。在IL-3存在下，生长速度明显减慢，倍增时间显著延长，而且自发凋亡增加2～3倍。然而，当IL-3撤除后，PLZF又能保护细胞免于凋亡。由此推测，在造血干细胞阶段高表达的PLZF可以维持干细胞于静止期及保持存活，随着细胞分化开始，PLZF表达下调，细胞进入周期并分裂，提示PLZF可能是一种抑癌基因。 2.PLZF- RARa 由PLZF的1－455aa和RARa的60～462aa构成，包含了PLZF的POZ/BTB结构域、第1、2锌指和RARa的B至F结构域。个别病例PLZF的1～484aa与RARa融合。PLZF- RARa可以形成同二聚体，也可与PLZF、PML、RXR形成异二聚体。PLZF- RARa可以结合于RARE，还可与RARa竞争结合RARE、RXR及辅助激活因子，PLZF的POZ/BTB结构域又与SMRT、N-CoR/mSin3/HDAC结合，即使药理剂量水平的ATRA也不能使之与复合物解离。因此，PLZF- RARa可以抑制RARa靶基因的表达，并且药理剂量的ATRA不能清除这种抑制。由此可以解释ATRA治疗t（11；17）（q23；q21）APL无效的原因。HDAC抑制剂曲谷抑菌素A（TSA Trichostatin A）或丁酸钠联合应用ATRA，一方面可以使PLZF-RARa中的RARa与SMRT、N-CoR/mSin3/HDAC解离，转而与辅助激活因子结合，另一方面可以抑制结合在PLZF上的HDAC的活性，因此可以消除PLZF-RARa对基因转录的抑制，PLZF- RARa转染的U937细胞及转基因的小鼠白血病细胞可被诱导分化。 3. t（11；17）（q23;q21）APL的发病机理 PLZF-RARa转基因小鼠发生慢性髓系白血病，而非急性白血病，提示RARa-PLZF也起重要作用。RARa-PLZF是由RARa的A区与PLZF的后7个锌指融合而成，它可以结合PLZF的DNA结合位点，激活转录。RARa-PLZF的转基因小鼠不发生白血病，只产生髓系造血异常。而将PLZF- RARa和RARa-PLZF两种转基因小鼠交配新得到PLZF- RARa和RARa-PLZF转双基因小鼠，这种小鼠发生APL，证实t（11；17）（q23;q21）APL的发病需要PLZF- RARa和RARa-PLZF两者的共同参与。可能是前者以显著负性作用抑制RARa靶基因转录，阻断髓细胞分化。而后者以显著负性作用抑制PLZF的功能，转录激活细胞周期素A的表达，使细胞生长能力增强。 (三)、t（5；17）（q35；q21）与NPM-RARa NPM（Nucleophosmin）基因位于5q35上，基因组跨度为25kb，由12外显子组成。由于转录后剪切的不同，编码产生294aa和257aa蛋白，两者只在羧基末端不同。NPM在肿瘤细胞、增殖细胞中高表达，表达高峰在S期和G2期，可以转化3T3细胞，其原因可能是NPM与肿瘤抑制因子、干扰素反应因子I（IRF1，interferon response factor 1）结合，后者可以激活靶基因转录，而发挥抗增殖作用，然而NPM可以抑制IRF1激活转录的能力。NPM可以结合转录因子YY1，使其由转录抑制因子转变为激活因子。t（5；17）（q35；q21）形成NPM-RARa融合基因。在一例t（15；17）APL cDNA文库中分离出的NPM- RARa有2种，一种是短型NPM- RARa（NPMs- RARa），长520aa，另一种是长型NPM- RARa（NPML- RARa），长563aa。两种均由NPM与RARa的60～462aa融合，NPMs- RARa含有NPM的1～117aa，而NPML- RARa含有NPM1～117aa和一段未明序列，可能是由NPM的非编码区编码产生。NPM- RARa可以结合RARE，与ATRA结合后激活靶基因的转录，因此，t（15；17）APL病例对ATRA敏感，白血病细胞可被诱导分化。NPM-RARa转基因小鼠发生APL样改变，ATRA也可诱导其分化。 （四）、t（11；17）（q13；q21）与NuMA-RARa 核基质有丝分裂器蛋白（NuMA，nuclear matrix mitotic apparatus protein）编码2115aa，分子量约230kd。NuMA是一种高丰度、高保守性蛋白，是分裂中期核结构单位，参与形成棒垂体和子代细胞细胞核。NuMA可能参与细胞凋亡过程，其可被Caspase-3和Caspase-6水解，去掉羧基末端，产生180KD的水解产物，后者可以破坏正常的核结构。NuMA- RARa 是从一例6个月龄的t（11；17）（q13；q21）APL患儿中分离获得，是由NuMA的1～1883aa与RARa的B-F区（60～462aa）融合而成。NuMA-RARa可能会与野生型NuMA竞争caspase，而干扰了细胞凋亡过程。也可能象其它RARa融合蛋白一样，NuMA-RARa显著负性作用抑制RARa靶基因转录。ATRA可以诱导t（11；17）（q13；q21）APL细胞分化，推测药理剂量水平的ATRA可以使NuMA-RARa变成转录激活作用。 |
2楼2006-06-19 13:07:49