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lilirong2009

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR引物



如图，我用手工设计了金黄色葡萄球菌ATCC6538总DNA中几种基因的引物，只有一种引物P出了基因，此种基因长度为2000多个bp,但是我手工设计的引物理论上应调取中间200bp的片段，但是通过marker比对看，P出来的是500-700bp间的片段，请问是什么原因? 另外，手工设计的其他几种引物都没有P出东西来,只能很模糊的看到引物二聚体，是什么原因啊？
  注：因为金黄色葡萄球菌ATCC6538的这几种基因并不能全部在genebank中找到，所以我通过blast和clustalW2 比对了几种金黄色葡萄球菌的基因，找出其中保守序列后用primer premier 5 手工设计的长度都为18bp的引物，引物公司合成后给的Tm大多为40多度。我退火温度设计了梯度温度为40-55℃，但是只有一种引物P出了基因，但基因长度不是预设的长度。到底是什么原因啊？
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1楼 2010-11-15 17:14:13
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hong303030

金虫 (小有名气)
lilirong2009(金币+1): 2010-11-16 08:40:59
引用回帖:
Originally posted by lilirong2009 at 2010-11-15 17:14:13:


如图，我用手工设计了金黄色葡萄球菌ATCC6538总DNA中几种基因的引物，只有一种引物P出了基因，此种基因长度为2000多个bp,但是我手工设计的引物理 ...

以前我也遇到过这种问题，可以优化一下PCR体系，还有PCR的扩增程序，以前普通程序扩不出来，我用touchdown的程序扩出来了，还就是你可以换一下扩增用的酶，试一下
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2楼2010-11-15 18:45:59
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gagalady

新虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-15 19:00:35
引物二聚体的存在 就说明 引物没用上
引物的Tm值是40多   你的退火温度应该比它低呀 怎么着也得低5度呀
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3楼2010-11-15 18:56:48
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磊leisure

金虫 (小有名气)
退火温度设置的很重要，你重新设置一下PCR反应体系吧
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4楼2010-11-21 09:45:53
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