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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】SDS-PAGE检测蛋白纯度
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求知的学生

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】SDS-PAGE检测蛋白纯度 已有11人参与

大家好，我现在有一些蛋白质的冻干粉，想用SDS-PAGE测一下纯度，应该如何做？胶跑完之后，该如何处理，怎么计算浓度？望不吝赐教，谢谢！
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1楼 2010-11-03 11:48:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
求知的学生(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-03 14:25:25
求知的学生(金币+1): 2010-11-03 17:11:00
蛋白粉加LOADING BUFFER后加热处理，再SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝或者银染，检测纯度。测浓度的话用考马斯亮蓝G250法595nm测定好了。具体操作一般的实验书上都有的。
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3楼2010-11-03 14:21:56
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tryhtr

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3):欢迎分享经验！ 2010-11-03 20:46:29
我们实验室的做法：
首先蛋白按说明书要求溶解后测蛋白浓度，如果你的蛋白比较纯，可以用UV280，BCA等方法
然后根据蛋白的浓度，计算约10ug上样跑电泳，原因是上样量要能够保证少量杂质也能显示在胶上。
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8楼2010-11-03 20:40:33
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-05 08:39:44
可以跑胶之后用bandscan分析目的条带的灰度和marker的灰度比然后估算浓度
但是SDS-PAGE测浓度只能半定量，不可能完全准确的
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
10楼2010-11-03 22:24:14
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hzxizh

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-05 08:39:57
既然是冻干粉，就会有些别的赋形剂或保护剂成分。实验前，一定要考虑这些物质的干扰。先搞清是什么东东，去做空白对照！
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13楼2010-11-05 07:05:22
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hzxizh

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by 隔岸之雨 at 2013-05-24 06:15:34
你好，测海带的蛋白质含量，冻干之后，可以直接用考马斯亮蓝G250法么？
蛋白粉加LOADING BUFFER后加热处理，再SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝或者银染，检测纯度，，
这里电泳是干什么的，，求解。。...

条件所限，电泳是来用作纯度检测的。
提醒:使用考马斯亮蓝测蛋白浓度和纯度，要注意试剂是不一样的，一个是G250，一个是R250！
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18楼2013-05-24 21:54:40
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先，你需要将你的蛋白溶解！然后加热处理之后电泳，电泳之后染色，通过相关仪器或者直接相机照相，利用bandscan来估计蛋白纯度！
2. 如果你想利用SDS-PAGE来测定蛋白浓度话，建议你在电泳时，在你蛋白旁边的泳道点一个BSA梯度（BSA浓度是确定的！例如你配一个0.5mg/ml），分别点1ug,2ug,4ug,6ug,8ug,10ug！电泳之后照相，利用PS，根据BSA比对的方法！首先将BSA的标准曲线做出来，然后根据你的protein的累计密度计算出他的质量，进而算出他的浓度！这种做法比一般的BSA比对方法可能更准确点！但是，利用SDS-page来测定蛋白浓度只是定性实验，如果想准确定量测定，建议你还是换bradford法或UV280等方法！

好吧，就这么多吧，希望对你有用！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
21楼2013-05-25 08:29:31
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普通回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
求知的学生(金币+1):谢谢参与
求知的学生(金币+1): 2010-11-03 13:02:39
蛋白定量测浓度
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2楼2010-11-03 12:31:36
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
★
求知的学生(金币+1):谢谢参与
楼上说得很全了，
另外建议，
如果自己没做过，还是找个此类实验室的好。

那些试剂自己配太麻烦了。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
4楼2010-11-03 16:10:59
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求知的学生

金虫 (小有名气)
谢谢各位的热心解答！
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5楼2010-11-03 17:12:16
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-03 18:19:30
试剂可以购买试剂公司的，现成的并且质量有保证，尤其是当你对配溶液不是很擅长的时候。
很多时候就是在配溶液的时候让实验出现了问题，最后连分析问题的时候都不知道从哪里下手。
测定方法3楼讲得很清楚了，注意点操作就OK了，祝你成功
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
6楼2010-11-03 18:13:41
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求知的学生

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2010-11-03 18:13:41:
试剂可以购买试剂公司的，现成的并且质量有保证，尤其是当你对配溶液不是很擅长的时候。
很多时候就是在配溶液的时候让实验出现了问题，最后连分析问题的时候都不知道从哪里下手。
测定方法3楼讲得很清楚了，注 ...

谢谢解答，我自己试一试。
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7楼2010-11-03 19:06:51
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muchong5577

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用SDS胶测浓度准确性不太好吧
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9楼2010-11-03 21:12:07
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