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1楼2006-05-28 13:55:31

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chensir7806

至尊木虫 (文坛精英)

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多肽抗生素研究进展

摘要　多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，一般具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。按照化学结构的不同，多肽抗生素可分为5类：①具有螺旋结构的线性多肽；②富含某种氨基酸的线性多肽；③含有一个二硫键的多肽；④含有两个或两个以上二硫键的多肽；⑤羊毛硫抗生素。根据作用机理的不同，多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。多肽抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面，并且有着很大的发展潜力。
关键词　多肽抗生素；裂解肽；作用机理

　　多肽抗生素是指相对分子质量通常在1×104以下，具有抗菌活性的多肽类物质。但是由于区分小肽与蛋白质的界限不很严格，不同学者对多肽抗生素的分子量上限有不同的观点。最初，人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“antibacterial peptides”，中文译为“抗菌肽”，其原意应为“抗细菌肽”。后来发现有些“抗细菌肽”还具有抗真菌等其它微生物的功能，便称之为“antimicrobial peptides”。但是随着研究的深入，人们相继发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌细胞等功能，尤其是随着这类多肽物质在医药学上的应用，许多学者倾向于称之为“peptide antibiotics”――“多肽抗生素”。也许是由于几乎所有的多肽抗生素都具有抗细菌的功能，“抗菌肽”作为一个约定俗成的名称，在国内依然被广泛采用。如果没有特殊说明，本文中的多肽抗生素特指由基因编码，在核糖体上合成的多肽抗生素。那些在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质的抗生素，如杆菌肽、多粘菌素E、短杆菌肽S等不在本文的讨论范围之内。
　　多肽抗生素研究的真正兴起是从20世纪80年代初开始的。1980年，Boman等人从美国天蚕蛹中分离得到了具有抗菌活性的多肽――cecropins，并于次年在《Nature》上公布了其氨基酸序列。同是在1980年，Lefur等人从兔的巨噬细胞中分离到了另一种多肽抗生素――defensins，并于3年后公布了其氨基酸序列。此后数年间，人们相继从细菌、真菌，到两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、直至人类体内，发现了多肽抗生素。目前，仅昆虫来源的多肽抗生素，就已达170余种。为了研究的方便，人们根据多肽抗生素的结构对它们进行了分类。
1　多肽抗生素的分类
1.1　具有螺旋结构的线性多肽　cecropins是第一个被发现的动物多肽抗生素，1980年，由Boman等［1］从美国天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。此后，人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇中分离到了cecropins类多肽抗生素。1989年，Lee等人从猪小肠中分离到了cecropin P1，说明了cecropins可能在动物中广泛存在。cecropins对革兰阳性菌、阴性菌都具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。目前cecropins已被人工合成并已商品化。
　　magainins也是较早发现的一类具有双亲螺旋结构的多肽抗生素。最初是从蟾蜍的皮肤中分离得到的［2］，后来在哺乳动物的神经组织和肠组织中发现了其类似物。magainins对革兰阴性菌、阳性菌、真菌、原生动物都有杀伤作用，但是对革兰阴性菌的活性比cecropins要低10倍左右。
　　此外，从一些动物的再生性器官和两栖类的多种组织器官中分离得到了一些具有螺旋结构的多肽，如来源于南美蛙的dermaseptin和来源于树蛙的bombininh。
1.2　富含某种氨基酸的线性多肽　apidaecins是从蜜蜂中分离得到的富含脯氨酸的多肽抗生素［3］，一般含有16～18个氨基酸残基，其中脯氨酸含量高达33％，精氨酸含量可达17％。其一级结构中具有PRP和PP的典型motifs。apidaecins对某些革兰阴性菌具有很强的活性，而对革兰阳性菌不起作用。apidaecins对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌科的致病菌的高杀伤力，使其在植物抗细菌病基因工程和食品工业中有着很好的应用前景。
　　drosocin是来源于果蝇的一种富含脯氨酸的多肽抗生素［4］，在结构上与apidaecin具有一定的相似性，但是在其11位的苏氨酸羟基上连接着一个O-二糖链(-N-乙酰半乳糖胺-半乳糖)。
　　coleoptericin和hemiptericin分别来源于鞘翅目和半翅目昆虫，一级结构中富含甘氨酸，分子量一般较大。Oppenheim等人从人的腮腺和下颌腺分泌物中分离得到了一组富含组氨酸的多肽抗生素，长度在7～38个氨基酸残基不等，被称为histatins。对于引起口腔感染的多种微生物具有活性。indolicidin是来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素，因其13个氨基酸中含有5个色氨酸而得名。其C端是酰胺化的。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很强的杀菌活性。
1.3　含有一个二硫键的多肽　这是一类数量很少的多肽抗生素，第1个被发现的这类多肽是bactenecin，来源于牛中性粒细胞［5］。其12个氨基酸中含有4个精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸残基间形成二硫键。bactenecin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有活性。
　　这类多肽中还包括一些来源于蛙类皮肤的多肽抗生素，一般在C端有一个由7个氨基酸形成的“loop”和一个长的N端“尾巴”，如brevinin-1，brevinin-2。
1.4　含有两个或两个以上二硫键的多肽　这类多肽的典型代表是defensins，最初发现的α-defensins来源于哺乳动物的组织中［6］，一般含有29～34个氨基酸残基，其中6个保守的半胱氨酸形成3个分子内二硫键，此外，其第6位和第15位的精氨酸，第24位的甘氨酸也是保守的。α-defensins可形成3层的β片层结构，通过3个二硫键和Arg-6与Glu-24之间的盐桥而被稳定。目前，defensins已被合成并已商品化。defensins对多种细菌和某些真菌具有杀伤作用，并且对真核细胞有一定的毒性。defensins对革兰阳性菌的活性比革兰阴性菌强。defensins的活性比cecropins弱，并且通常在低离子强度下起作用。
　　β-defensins比α-defensins大一些，一般含有38～42个氨基酸残基。都含有3个二硫键和4～8个精氨酸。
　　昆虫defensins在C末端与α-defensins相似，但是只有两个β片层结构，中间有一段α螺旋起稳定作用。主要对革兰阳性菌起作用，而对真菌没有作用。
　　植物defensins一般有45～54个氨基酸残基，可形成4个二硫键，3个β片层结构和一个α螺旋结构。植物defensins一般只对真菌起作用而对细菌没有作用。不同植物defensins对真菌的抗菌谱不同。
　　thionins也是一类来源于植物的多肽抗生素，含有45～47个氨基酸残基，有6个或8个半胱氨酸形成的3个或4个二硫键。其二级结构可形成2个反平行的α螺旋结构和2个反平行的β片层结构。thionins抑制多种植物致病细菌和真菌，但是对假单孢菌属和欧文氏菌属的细菌不起作用。
1.5　羊毛硫抗生素　羊毛硫抗生素(lantibiotics)是指一些由细菌产生的，由基因编码，在核糖体中合成，经翻译后加工而含有一些特殊有机基团的多肽抗生素。其中研究最广泛的是nisin。它是来源于乳酸菌的一种多肽抗生素，成熟多肽由34个氨基酸组成，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基团。主要对革兰阳性菌起作用，而对革兰阴性菌不起作用。已被广泛应用作食品保鲜剂［7］。nisin及其类似物在医药上的应用研究也正在进行。
2　多肽抗生素的生物学活性
2.1　多肽抗生素对细菌的杀伤作用　大多数多肽抗生素都具有抗细菌的作用。目前认为cecropins、magainins、defensins等许多可形成双亲螺旋结构的多肽抗生素是通过作用于细菌的细胞膜，在膜上形成离子通道，引起胞内物质的外漏而杀死细菌的。通过对sarcotoxinIA的研究发现，当在脂质体中存在胆固醇时，sarcotoxinIA对其的裂解作用减弱。这可部分解释这类多肽对真核细胞不起作用的原因［8］。
　　apidaecins类多肽抗生素对细菌的作用机制是非裂解机制，可能是通过与膜上的手性分子相互作用进而杀死细菌的。
2.2　多肽抗生素对真菌的杀伤作用　许多多肽抗生素除了具有抗细菌的活性外，还具有抗真菌的作用。如来源于蛙类的PGQ，dermaseptin和哺乳动物的defensins对一些人类致病真菌具有杀伤作用，其中兔defensinNP-1对玉米的致病真菌也有作用。一些来源于植物的多肽抗生素，如植物defensins、thionins等对多种植物致病真菌具有杀伤作用。最近，Cavallarin等［9］发现cecropin衍生物N末端α螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关。
2.3　多肽抗生素对原虫的作用　一些多肽抗生素可以有效地杀灭寄生于人类或动物的寄生虫。如Shiva-I(一种cecropin的类似物)可以杀死疟原虫；一种cecropin/melittin的杂合肽可以杀伤莱什曼鞭毛虫。
2.4　多肽抗生素对病毒的作用　目前发现多肽抗生素可以3种不同的机制起到抗病毒的作用［10］。第1种是通过多肽抗生素直接与病毒粒子相结合而发挥作用。如α-defensins，modelin-1等对疱疹病毒的作用，polyphemusins对HIV病毒的作用。第2种是抑制病毒的繁殖，如mellitin和cecropin A 对HIV病毒的作用。第3种机制是通过模仿病毒的侵染过程而起作用。如melititn及其类似物K7I的结构与烟草花叶病毒核衣壳与mRNA相互作用的区域具有相似性，通过干扰病毒的组装而对病毒产生作用。
2.5　多肽抗生素对癌细胞的作用　许多研究显示与正常细胞相比肿瘤细胞对多肽抗生素更敏感，目前对引起这种差别的原因还不完全清楚，初步认为与以下几个因素有关［10］：①由于肿瘤细胞的高代谢引起细胞膜电位的改变；②肿瘤细胞膜外表面含有更高的酸性磷脂；③肿瘤细胞的细胞骨架或胞外基质的变化。目前已经发现cecropin及其类似物，magainin2及其类似物，cecropinA-magainin2, cecropinA-melittin杂合肽及其类似物都对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。
3　多肽抗生素的合成
3.1　化学合成法　为了研究多肽抗生素的作用机制，许多天然多肽抗生素及其类似物已通过固相合成的方法得到。其中研究最多的是具有双亲螺旋结构的带正电荷的多肽。通过改变或增删多肽某些位置的氨基酸，可以研究多肽抗生素一级结构的保守性。在研究该类多肽抗生素与细菌细胞膜的相互作用时，利用D-型氨基酸合成了天然多肽的对映体。天然多肽形成左手螺旋，而其对映体形成右手螺旋，发现D-型氨基酸形成的对映体与天然多肽具有相同的生物活性，从而进一步证明了双亲螺旋结构在该类多肽的生物活性中具有重要作用。为了寻找具有更高抗菌活性或更广抗菌谱的多肽抗生素，一些杂合肽相继被合成。例如，由cecropin和melititn的前13个氨基酸组成的杂合肽CN(1～13)MN(1～13)具有很强的抗菌活性而无溶血活性［11］。为了节约成本，人们也在试图寻找更短的具有抗菌活性的小肽。化学合成法可以方便地在合成过程中改变多肽的一级结构，加入特殊氨基酸，对多肽末端进行修饰，但是昂贵的成本是限制该方法工业化应用的最大障碍。
3.2　基因工程合成法　利用基因工程的方法生产多肽抗生素是降低生产成本的一条有效途径。但是多肽抗生素对原核细胞的毒性在一定程度上限制了其在原核表达系统中的应用。而真核表达系统的较低表达效率也是其工业化生产的一个障碍。为了克服多肽抗生素对细菌细胞的毒性，人们采用融合表达或选择对多肽抗生素具有抗性的株系进行原核表达。最早Jaynes于1989年在大肠杆菌中融合表达了Shiva-I基因。1993年，Piers等［12］将defensin，HNP-1，cecropin/melittin杂合肽基因分别与4个不同的载体蛋白相融合，并在大肠杆菌中进行表达。对表达产物的产量、细胞定位、蛋白降解情况进行了较为系统的研究。对其中的一些融合蛋白进行化学裂解或酶解后，得到了具有抗菌活性的小肽。
　　1993年，Maeno 等［13］利用链霉菌表达系统分泌表达了apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的产物。1992年Reichhart等［14］在酵母中成功表达了具有正确二硫键配对的绿蝇defensin A，产量最高可达每ml培养基2.5 μg。1991年，Andersons等［15］利用多角体病毒表达系统在昆虫细胞系中表达了cecropinA的融合蛋白，C末端未见酰胺化，后来利用活体昆虫进行表达，产量提高了60倍，并且部分产物被酰胺化。在国内，谢维等［16］在大肠杆菌中表达了家蚕多肽抗生素CMIV。1999年，沈俊卿等［17］在酵母中表达了cecropin的类似物。
Tab 1　Therapeutic status of peptide antibiotics
Company Peptide Clinical indication Stage of development
Magainin Pharmaceuticals MSI-78(α-helical) Impetigo Abandoned after phase Ⅲ (1997)
　 MSI-78 Topical treatment of diabetic foot ulcers PhaseIII (1997)
Applied Microbiology/Astra/Merck Nisin(lantibiotic) Gastric Helicobacter infection/ulcers Early clinical trails (1997); PhaseI (1998)
Applied Microbiology/Nippon/ Shoji Nisin variants Vancomycin-resistant enterococci (parenteral) Preclinical research (1997)
Micrologix Biotech MBI-11CN+ Gram-positive infection Preclinical research (1997)
　 MBI-20 series(α-helical) Gram-negative infection; enhancers of conventional antibiotics Research and development (1997)
Intrabiotics IB367(β-sheet) Topical treatment of oral mucositis(muoth ulcerations) Preclinical research(1997); PhaseI (1998)
Xoma Mycoprex(BPI-derived) Systemic candidiasis; enhancer of fluconazole activity Preclinical research (1997); PhaseⅡ completed，PhaseⅢ initated(1998)
4　多肽抗生素的应用及前景
4.1　多肽抗生素在医药工业中的应用及前景　目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。多肽抗生素因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景［18］。目前，已有多种多肽抗生素正在进行临床前的可行性研究，其中magainins已经进入三期临床试验阶段。一些多肽抗生素在医药研究中的进展情况见Table 1。
　　现在大多数临床试验是用于局部治疗，这种治疗应该是安全和有效的，因为一些毒性更强的多肽和脂多肽，如短杆菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮肤软膏。这些多肽也可用于那些常规抗生素和常规疗法无效的地方。利用粉剂的方法治疗肺部感染是一个很有前途的发展方向。口服药物可能会被用于治疗肠道感染，nisin正在进行抗螺旋杆菌的临床试验。至少有两个公司正在开发非肠道给药的治疗方法。但是，多肽抗生素要真正用于临床，必须首先要解决以下问题：多肽抗生素的毒性、稳定性、免疫原性、应用方法、药物配方。药物配方是影响治疗效果的一个主要问题。此外，体内蛋白酶，尤其是胰蛋白酶对多肽的降解，不同组织器官对多肽的吸收情况都有待于进一步的研究。
4.2　多肽抗生素在其他方面的应用及前景　由于某些多肽抗生素对一些植物致病细菌和真菌具有很强的抗性，一些多肽抗生素已经被用于植物抗病基因工程［19］。如Jaynes等将两个cecropin的类似物基因，Shiva-I基因和SB-37基因转入烟草，发现Shiva-I的转基因烟草对青枯病具有一定的抗性，而SB-37的转基因烟草没有抗性。Huang 等的研究表明将cecropin类多肽MB-39基因与大麦α淀粉酶信号肽基因融合后转入烟草中，所得植株对野火病的抗性增强。在国内，黄大年等［20］利用cecropinB基因转化水稻，得到了一些对水稻细条病具有不同抗性的植株。
　　多肽抗生素动物转基因的研究也已经取得了一些进展，比如可以通过基因工程的方法来阻断一些虫媒疾病的传播，Possani等［21］的研究表明，在蚊子体内表达Shiva-3可以抑制疟疾的传播，但是在蚊子的转基因技术方面还存在着一些困难；Durasula等［22］通过在长红猎蝽的共生菌中表达CecropinA明显减少了其体内锥虫的数量。Reed等［23］将Shiva-Ia转入小鼠中，转基因小鼠对布鲁氏杆菌的抵抗力显著增强，这为人工培育抗病饲养动物新品种提供了新思路［23］。此外，多肽抗生素在食品防腐，鲜花保鲜和动物饲料添加剂等方面的应用研究也正在进展之中。