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【求助】多糖分子量测试结果不正常已有10人参与
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我做植物多糖，采用水提醇沉法，再用SEPHAX-100分离，收集苯酚硫酸显色部分，透析、冻干。用高效凝胶色谱测试。却发现结果不如人意，主峰分子量只有几千。而我的透析膜10000以下应该是不存在的。条件与结果见附件，请高手帮忙分析下原因。 多糖分子量测定方法：高效凝胶过滤色谱法（HPGFC） 仪器：Waters 600 高效液相色谱仪（配2410示差折光检测器和M32工作站） 色谱条件： 色谱柱：Ultrahydrogel™Linear 300mm×7.8mmid×2 流动相：0.1N硝酸钠 流速：0.9ml/min 柱温：45℃ 样品制备：称取样品100mg于25 ml容量瓶中，用流动相溶解，定容。 分子量校正曲线所用葡聚糖标准品(均购置于sigma公司)： Dextran T-2000 (MW2000000) DextranT-580( MW580000) Dextran T-70 (MW70,000) Dextran T-10 (MW10,000) Dextran T-5 (MW2900) Maltaose (MW342) 2# Retention Time Mn Mw MP Polydispersity Area % Area 1 19.850 36588 39753 25394 1.086519 39355 3.65 2 22.117 2341 4670 3914 1.994919 1039324 96.35 |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
zznjut(金币+2):3Q 2010-11-05 22:28:12
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zznjut(金币+2):3Q 2010-11-05 22:28:12
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虽然楼上两位说的都有道理，但是可能影响因素还要多啊。由于主峰占了96%以上，而分子量只有几千，你又说不会有1万以下的，所以可能是样品与柱子填料有键和，造成了不正常的晚馏出，也就是楼上说的：可以尝试调节一下pH值，或者换种盐，总之要解开样品的电性、或者样品与柱子填料的吸附，才能分离好。 最好有激光散射检测器，因为可以一步测到绝对分子量，这样就减少了可能的影响因素，便于分析出来到底是什么原因了。例如：如果光散射LS测到主峰绝对分子量有好几万，那就简单多了：很可能是样品有电性、柱子上有吸附或键和。就可以尝试调节pH值、换用别的柱子等等。如果LS测到确实只有几千，那还要找其它原因了。但至少可以缩小可能性的范围了。 另外，我觉得你的校正曲线好像也有点儿问题。做校正曲线不是为了做出来这条曲线，而是为了使你的样品测试能够准确！所以，首先你应该对你的样品的大致分子量做到心中有数，然后根据这个大致范围，选择合适的标样，再做标准曲线，让标准曲线正好涵盖了你的样品的分子量范围，既别太宽泛也别太窄了，而这个范围以外的部分则可以忽略了。例如：你的样品分子量是1万到20万之间，不会超过50万，那么你就在选择1万和20万之间多选择几种标样：5千、1万、5万、9万、12万、17万、20万、24万等等，大分子量段，选择一两个靠谱的就行了，这样做出来的曲线，在你的样品范围可能更精细、准确。你现在的标样，本身就有点儿少，只有5、6个，而且我觉得58万和2百万的全浪费了啊，实测范围的那部分却只有两三个标样，我觉得偏差可能会较大。好像植物高分子样品，一般都不会太大吧？不必选择2百万的标样。对于多糖，我不太熟悉了。我印象当中，弱酸性的居多吧？也就是pH值达约在6--6.8之间吧。我也不敢保证对啊，呵呵。 |
5楼2010-11-05 22:20:14
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