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320080920001金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】蓝白斑筛选实验原理
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我们要做DNA转化实验，但在预习时有几个问题，想请请教大家帮忙解答一下： 1、受体为大肠杆菌JM109，载体为质粒pUC19Vector. 请问质粒pUC19Vector上带有的β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息是来自大肠杆菌吗？即这个质粒是人工构建的吗？ 2、JM109 宿主菌染色体上带有Lac Z的C端部分编码信息，质粒载体与Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌突变体之间的这种互补作用称为α-互补。 请问JM109没有β-半乳糖苷酶基因的操纵子序列，是如何起始表达的？ 3、我附了张PPT的图片，里面说α肽和c端部分由于α互补形成有活性的β-半乳糖苷酶，而α-肽中加了一段外源基因产物就无法和c端结合，不能互补。 问题是之所以不出现白斑而显示蓝斑不是因为只转进空质粒吗？这个外源基因从何而来？ |
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320080920001(金币+1):这些在实验原理中都写得很清楚，我也相信我明白原理了，但是好像你没有看懂我写的第一个和第二个问题，这样粘贴的回答不济于事啊 2010-10-28 20:56:49
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蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。 现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 |
5楼2010-10-28 20:47:19
320080920001
金虫 (正式写手)
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