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[交流]
【求助/交流】引物及PCR产物连入载体的问题求助！！！
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今天看文献遇到点问题不太明白，请教大家： 1，设计一对引物扩增某基因，引物如下：, 5‘-GCGGCGGAATTCATGGCTAG TATCAAACAAATAG-30’ containing the ATG start codon, introduced an EcoRI restriction site (underlined), and the carboxyl terminal primer 50-GCGGCG TCTAGATCACTTGA CCCTGAGTCTTC-30, including the stop codon, introduced an XbaI restriction site. 问题：起始密码子和终止密码子前面均引入酶切位点序列，但是酶切位点序列前面的一段序列是用来做什么用的？（GCGGCG）。此外，引物的退火温度计算的时候是按照序列全长计算？or按照酶切位点后的序列计算？ 2。加入酶切位点后的引物扩增出来序列是否粘性末端？能否直接连入T-载体？本文实验方法中说扩增结果纯化后直接连入pGME-T载体，然后转到E.coli DH5a中去测序。T载体不是末端为一个T碱基的粘性末端吗，PCR结果必须是多一个A碱基的粘性末端才能连接上（本人理解）按照我这样的理解，解释不了文中直接将产物连接到载体中，望高人解疑！！！ |
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feiye2214
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3楼2010-10-24 18:44:04
feiye2214
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据我所知，对你问题的解答如下： 1.你提到的酶切位点前面的序列是保护碱基，一般3-4个，你这个有点多，但性质是保护碱基，保护酶切位点，因为在末端容易降解、丢失 2.PCR之后的序列就可以连上T载体啊，怎么可能是粘性末端呢？3‘端有A重复是taq酶的特性，所以才有TA克隆这项技术。你TA克隆后再去酶切，因为你在引物里已经设计了酶切位点，（个人觉得，设计的酶切位点应该不能和T载体上的酶切位点重复），酶切后才有粘性末端，再和同样酶酶切的载体质粒（酶切后是线性的）连接，重组质粒再转化大肠。就好了 希望有所帮助 |
2楼2010-10-24 18:42:27
