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【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？ 已有8人参与
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3月份做过一次，在200mM咪唑和500mM咪唑洗脱组分中都有很纯的目的蛋白。最近做的时候，总是有杂蛋白。用平衡液洗杂蛋白的体积和时间是差不多的。不知道为什么就是不纯？ 蛋白是重组菌落经IPTG大量诱导表达得到。在优化后的条件下表达。（适于可溶性目的蛋白表达）。 还有，我这周在纯化时所用的所有液体都保持在4度左右，这会不会对过柱有影响呢？  |
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3楼2010-10-23 23:59:17
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2楼2010-10-23 20:54:06
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我看是你的胶没有跑好！！！ 看看上面的杂带在10----500的分布是一样的。有可能是你上清的样品漏到电泳液中了，或者在分离胶和浓缩胶的结合处沿平行方向穿透了。 再跑一块胶看看吧。看看样品在浓缩胶和分离胶接触的地方有没有扩散开来？ 使用ni柱一步就能把蛋白纯化到很高程度的蛋白只能是可遇而不可求的，并不是每个蛋白都能做到（除非加入蛋白酶切）。从你三月份的电泳图来看你的蛋白还算是不错，比较纯了。 如果想获得较为纯的蛋白，建议在wahing的时候加大buffer的使用量，充分洗涤。搜索洗涤咪唑的最高浓度，在目的蛋白脱离不明显的时候尽可能提高咪唑浓度。 |
4楼2010-10-24 00:09:54
brightfuture01
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5楼2010-10-24 00:34:24
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