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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
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xmasylm

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？ 已有8人参与

3月份做过一次，在200mM咪唑和500mM咪唑洗脱组分中都有很纯的目的蛋白。最近做的时候，总是有杂蛋白。用平衡液洗杂蛋白的体积和时间是差不多的。不知道为什么就是不纯？
蛋白是重组菌落经IPTG大量诱导表达得到。在优化后的条件下表达。（适于可溶性目的蛋白表达）。
还有，我这周在纯化时所用的所有液体都保持在4度左右，这会不会对过柱有影响呢？
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1楼 2010-10-23 20:20:42
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-24 08:39:27
你以前的也不怎么纯啊。
我看着像是降解的原因。理由就是杂带都比你的目的带小。你可以加点蛋白酶抑制剂试试。
低温好像对ni柱影响不大。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2010-10-23 20:54:06
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-24 08:39:35
与你放在四度有些关系吧…温度对缓冲液的pH有影响的…进而影响洗脱…稍微改变一下pH或者按照上次实验条件去做…不过一般来说纯化过程本身就应该在四度进行…缓冲液也是四度保存的…
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2010-10-23 23:59:17
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月月大可

木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-24 08:39:43
lstt09nk(金币+2):辛苦，追加金币 2010-10-26 12:38:27
我看是你的胶没有跑好！！！

看看上面的杂带在10----500的分布是一样的。有可能是你上清的样品漏到电泳液中了，或者在分离胶和浓缩胶的结合处沿平行方向穿透了。
再跑一块胶看看吧。看看样品在浓缩胶和分离胶接触的地方有没有扩散开来？

使用ni柱一步就能把蛋白纯化到很高程度的蛋白只能是可遇而不可求的，并不是每个蛋白都能做到（除非加入蛋白酶切）。从你三月份的电泳图来看你的蛋白还算是不错，比较纯了。
如果想获得较为纯的蛋白，建议在wahing的时候加大buffer的使用量，充分洗涤。搜索洗涤咪唑的最高浓度，在目的蛋白脱离不明显的时候尽可能提高咪唑浓度。
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4楼2010-10-24 00:09:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-24 08:39:51
如果你之前buffer是常温配制，是在常温条件下作的话这次也用常温条件来做才有说服力，因为温度对pH的影响很大，常温25度和4度，如果是Tris缓冲液的话，pH会差很多，因为Tris的缓冲能力不是很强。

楼主跑PAGE的技术不过关或者是实验室的扫描仪很差了，图不好看。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2010-10-24 00:34:24
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月月大可

木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+2):热心鼓励。 2010-10-25 08:29:57
室温下到4度，tris的ph大约能升高0.5  
ni柱是在ph接近8的时候才表现为较强的结合力。

我不认为是你换温度的问题，依然认为你上清的上样量过大，整个都跑成一团了！
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6楼2010-10-24 19:50:50
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
★
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非特异性吸附？
wash buffer 洗的不彻底，多洗几遍 会减少一些非特异性吸附
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与人玫瑰手有余香
7楼2010-10-26 12:12:38
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
★
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8楼2015-09-25 21:42:46
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O-rigin

新虫 (初入文坛)
★
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可溶性表达的蛋白纯化时洗脱液中需要加尿素吗？
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9楼2016-09-27 15:33:33
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★
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我也碰到这个问题，第一次做纯化，纯化后背景条带不干净，还有很多杂带。不知如何清除
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10楼2017-11-22 04:29:06
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