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zheng20089829

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酵母表达外源蛋白,His-tag降解怎么办

最近在毕赤酵母中表达一个40kd左右的蛋白,电泳发现有两条带,且随着时间的延长,底下那条带不断变浓,上面的带基本没有变化,用镍柱纯化吸附的只是上面的带,下面的带基本全部穿透,但测活性都有,且穿透峰活性更高,请教各位是不是由于组氨酸尾降解造成的,有什么方法可以避免。
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zheng20089829

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lulu1986 at 2010-10-08 20:11:18:
这两个带差别很大吗?六个his标签才有多大的分子量,如果能够明显区分,那么肯定不是标签降解的原因!

差别还是明显的,但下面的带完全不会吸附~现在也不是很清楚什么原因
5楼2010-10-09 12:55:03
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181587941

金虫 (正式写手)

提供几个防止降解的办法

★ ★ ★ ★
zheng20089829(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+3):感谢参与~ 2010-10-07 13:17:55
目的蛋白可能是降解了。防止的方法有以下几个:
一、低温表达,可控制诱导温度在22度到25度,具体的可以摸索一下
二、找一个合适的ph,我们表达的时候发现ph超过6很容易降解。
三、发酵过程中加入蛋白酶抑制剂
四、构建菌株时破坏掉蛋白酶的基因。

如果实在没办法,就想办法提高表达量,缩短诱导时间。
3楼2010-10-07 12:13:45
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)


zheng20089829(金币+1):谢谢参与
这两个带差别很大吗?六个his标签才有多大的分子量,如果能够明显区分,那么肯定不是标签降解的原因!
Nothingisimpossible!
4楼2010-10-08 20:11:18
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zheng20089829(金币+1): 谢谢参与
6楼2016-10-16 00:35:21
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