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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教RNA二级结构对反转录的影响
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教RNA二级结构对反转录的影响 已有6人参与

最近反转感觉总是拿不到全长，请问二级结构会对反转有影响吗？我用AMV反转的。二级结构如图（不太会做，随便找了个软件预测的）：
[img][/img]
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1楼 2010-09-06 16:15:47
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
等待高人指点！
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2楼2010-09-06 21:18:31
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hacherboy

银虫 (小有名气)
友情帮顶~~
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3楼2010-09-06 23:27:20
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
友情帮顶
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小木虫之有关部门负责人
4楼2010-09-06 23:54:19
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-09-06 21:18:31:
等待高人指点！

谢谢~~
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5楼2010-09-07 08:47:56
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hacherboy at 2010-09-06 23:27:20:
友情帮顶~~

谢谢~~
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6楼2010-09-07 08:48:11
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
65℃足够打开这些二级结构了，拿不到全长还有几个可能：
1、rna降解
2、酶活不够
所以rna鉴定看看，然后酶是不是能换支新的，superscriptIII是我用的感觉比较好的逆转录酶
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7楼2010-09-07 08:58:32
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-07 12:12:15
1、当然有影响！65-70℃变性打开二级结构后立刻冷却，防止退火。
2、全长的获得不一定是反转录的问题，也许是模板的问题——可以在提取总RNA时候多多注意，用好一些的试剂，我们用的是Trizol，或者Qiagen的盒子。其他所有试剂一律色谱级。
3、可以纯化，即得到mRNA后再做反转录！效率不是一个级别的。
4、AMV的活性很高，但是推荐你使用Rnase阴性的MMLV等。
5、目的gene多长？2k以内就好一点，再长了不好拿，过3.6kb的，分了几段拿出来的。
6……影响因素太多了！
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8楼2010-09-07 09:39:49
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-09-07 08:58:32:
65℃足够打开这些二级结构了，拿不到全长还有几个可能：
1、rna降解
2、酶活不够
所以rna鉴定看看，然后酶是不是能换支新的，superscriptIII是我用的感觉比较好的逆转录酶

非常感谢！！
RNA降解不好说，不过比值都还好，1.9左右吧，酶是刚买的，应该问题不会很大，就是没有做预变性，不太清楚是不是这个原因，谢谢！
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9楼2010-09-07 12:30:56
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
lhwei1987:编辑内容 2010-09-07 12:37
引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-09-07 09:39:49:
1、当然有影响！65-70℃变性打开二级结构后立刻冷却，防止退火。
2、全长的获得不一定是反转录的问题，也许是模板的问题——可以在提取总RNA时候多多注意，用好一些的试剂，我们用的是Trizol，或者Qiagen的盒子。 ...

我用CTAB法提的，RNA感觉还行吧，
[img][/img]
用的L3，下次先变性试试，非常感谢！！

[ Last edited by lhwei1987 on 2010-9-7 at 12:37 ]
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10楼2010-09-07 12:35:29
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