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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌中蛋白表达量偏低，大家有什么建议？
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月月大可

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌中蛋白表达量偏低，大家有什么建议？ 已有9人参与

一直在做蛋白的原核表达与纯化，目前遇到的一个蛋白表达量偏低，不知道大家有何建议？

构建在pET28a载体上，170AA。稀有密码子分析显示个数很少，没有连续串联出现；同源度77%（氨基酸）功能相同的另一蛋白表达量却大的惊人；一般都是培养至OD在1.6-2.0左右加入1mM IPTG  37℃下诱导4h。蛋白完全上清表达，具有极高的稳定性（可以使用沸水浴破菌，依然有活性）。尝试过使用Rosetta（DE3）菌株，无明显效果。

疑问：
1、更换载体是否有可能对蛋白的表达量产生极大的影响？
2、加入融合蛋白（MBP GST等）会不会明显提高蛋白表达量？
3、是否还有其他提高蛋白表达产量的建议？
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1楼 2010-08-19 23:19:23
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bunny0512

银虫 (小有名气)
★
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月月大可(金币+1):谢谢 你师姐很执着 2010-08-21 18:35:42
1、更换载体是否有可能对蛋白的表达量产生极大的影响？
      应该是有影响的，比如我用GST带我的目的基因，蛋白量几乎没有
      换了带strep标签的质粒就有少量表达，不过不好纯化

2、加入融合蛋白（MBP GST等）会不会明显提高蛋白表达量？
      如上所述，用GST标签后纯化的另一个蛋白，表达量很好，也很纯

3、是否还有其他提高蛋白表达产量的建议？
      本人懂的也不多，我一个师姐曾经为了表达一个蛋白换了十几种载体，最后表达出来了，有的时候真的需要运气。
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在哪里~在哪里见过你~
8楼2010-08-21 10:24:51
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chenyuqin

新虫 (小有名气)
★
月月大可(金币+1):应该没有毒性，同源蛋白表达的很欢 2010-08-29 16:43:38
silicare(金币+1):谢谢交流 2010-08-31 08:33:05
1。尝试换载体，我曾经也有类似问题，后来换了载体就好了；
2。感觉你诱导之前的OD应该0.6-1.0比较好；
3。蛋白是否有毒性。
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where there is a will,there ia a way.
18楼2010-08-23 15:19:44
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普通回帖

看天

木虫 (知名作家)
★
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最近生物科学帖子更新很快 要想持续得到回答 得自己顶贴
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
2楼2010-08-20 14:07:38
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
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月月大可(金币+1):谢谢，正在更换中 2010-08-21 18:34:00
听说换载体有时效果会很明显。
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3楼2010-08-20 14:16:01
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月月大可

木虫 (著名写手)
我是在考虑换载体，已经发送了新引物


只是感觉这种方法不一定有效，只能尝试了。
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4楼2010-08-20 17:08:04
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王家大成

木虫 (正式写手)

囧囧小虫
★
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月月大可(金币+1):谢谢 2010-08-21 18:34:15
用融合蛋白的方法还是值得一试
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一念起，万水千山；一念灭，沧海桑田！
5楼2010-08-20 18:07:15
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夜龙舞

金虫 (小有名气)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励交流 2010-08-20 20:26:38
月月大可(金币+1):预测显示没有信号肽，不过我还是对前面的一段序列很怀疑。 2010-08-21 18:35:14
你构建载体时把信号肽序列去除了么，没有的话分泌到胞外，得率就非常低了。
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6楼2010-08-20 18:27:35
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月月大可

木虫 (著名写手)
没有信号肽
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7楼2010-08-20 21:58:08
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fjinliu

银虫 (初入文坛)
★
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月月大可(金币+1):我感觉载体的更换需有明确的目的性 2010-08-21 18:36:33
换载体可行得通，我遇到过同样的问题，换了几个载体才表达出来。
也可以考虑换个菌株！
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9楼2010-08-21 10:34:39
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自由飞扬

铁虫 (初入文坛)
★
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月月大可(金币+1):OD在0.6只是常规培养方法，当溶氧变大的时候OD可以考虑退后 2010-08-21 18:38:21
OD 1.6~2.0才诱导？ 太晚了吧

你换成在 0.6~1.0诱导，表达量估计就上去了
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我了个擦，这倒霉ID不是我自己起的不是我自己起的
10楼2010-08-21 10:53:59
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