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dabizi_911

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】原代细胞的分离与纯化培养

咱们原代细胞从动物体中分离,有没有什么技巧呢,分离后纯化单一的细胞有什么好的技巧没,希望大伙多多说一下自己的观点,我以后也是做细胞的。谢谢
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chiscien

铁虫 (初入文坛)



dabizi_911(金币+1): 谢谢参与
原代细胞纯化的方法,看什么方法适合你,希望对你有所帮助:
(1)酶消化法
在消化培养细胞时,常是成纤维细胞先脱壁,而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁,特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显,因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。
(2)机械划除法
原代培养成功后,上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现,混杂生长。这种混杂生长常常分区成片,每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
(3)反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比,其贴壁过程快,大部分细胞常能在短时间内大约10-30min完成附着过程,而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定,稍加振荡即浮起,这样可以利用此差别来纯化细胞。
13楼2012-05-11 13:36:18
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sandra2128

金虫 (小有名气)

★ ★
dabizi_911(金币+1):谢谢参与
看天(金币+1):鼓励一下 2010-08-20 22:53:32
1、无菌操作很重要。我平时是去下载组织后用75%酒精浸泡2-3min,然后用生理盐水洗15遍以上。
2、工具很重要。俗话说磨刀不误砍柴工,有好的工具在手,剥离或者切割就不会浪费很长时间,保证了整个分离过程的时长不会对细胞活性造成影响。
3、media很重要。事先把media准备好,分离出来后及时加上media,保证细胞活性。记得加pen/strep。原代时可适量加倍。
4、按时换液。原代及时换液可以防止污染。
暂时就能总结这么多了。以后想起来再补充吧
静而后能安;安而后能思;思而后能得。
2楼2010-08-18 02:43:33
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mafang68

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
dabizi_911(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):新虫,鼓励交流~~ 2010-08-22 09:09:58
1 提取时速度要快,提前把材料准备好,想周全,做实验时拿来就用,不要现找
2 保证无菌,分离时可加双抗;PBS里还可以加上血清,保证细胞状态好
3 分离后的细胞要纯化,可通过不同群的细胞是否贴壁等简单纯化;要想纯度高,可用磁珠分选,不过价格高
4 一些细胞要保持活性需在培养时加入细胞因子。我分离的淋巴细胞就需要IL-2;树突状细胞则需加GM-CSF和IL-4
知道的就这么些了
木虫啦,哈哈
3楼2010-08-18 08:51:31
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夜龙舞

金虫 (小有名气)


dabizi_911(金币+1):谢谢参与
原代细胞培养是组织消化后细胞量非常巨大,一般要计数后再放进方瓶内培养,但是都嫌麻烦不怎么做,这是要取舍,舍弃一定量的单细胞悬液,而且原代细胞要传几代稳定了再做实验。只要严格细胞操作技术规范,一般没有问题。
4楼2010-08-18 09:01:00
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