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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒转不进农杆菌
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tianhang

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】质粒转不进农杆菌已有7人参与

已经做了几次农杆菌感受态了，可是还是转不进去质粒。每次涂完板都长的很少的菌落，鉴定后也没有目的带。有时候有目的带摇起来的菌液有没有目的带。好不容易菌液有条带，保种之后再摇就又没有了。太折磨人了！哪位大侠能帮帮小弟，感激不尽啊~有没有比较好农杆菌感受态制备方法，是发根农杆菌~
谢谢啦
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1楼2010-08-09 17:39:05
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周_yan

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我前段时间也遇到了同样的问题，总是筛不出带来，感觉总是转不进去；后来我又重新设计了一个引物与原来的不同的引物再筛就行了，发现前面筛的那些都是。可能的原因是转入农杆菌之后原来的引物序列丢失了或者有特殊结构使其不能配对。你可以试一试这个方法。
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3楼2010-08-10 10:56:09
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普通回帖

chengao001

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒丢失？我做转化时感觉挺好转的啊，平板上张得转化子少，但是基本上都是需要的。
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2楼2010-08-09 20:31:39
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tianhang

新虫 (小有名气)
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Originally posted by 周_yan at 2010-08-10 10:56:09:
我前段时间也遇到了同样的问题，总是筛不出带来，感觉总是转不进去；后来我又重新设计了一个引物与原来的不同的引物再筛就行了，发现前面筛的那些都是。可能的原因是转入农杆菌之后原来的引物序列丢失了或者有特殊 ...

那么说可能是引物的问题？引物在检测质粒的时候好用，但是由于质粒进入农杆菌后会产生变化？然后引物就不好用了么？请问你后来重新设计的引物与原来的有什么不同？需要在哪些地方改进？谢谢你的帮助哈~祝你试验成功~
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4楼2010-08-12 08:29:40
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tianhang

新虫 (小有名气)
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Originally posted by chengao001 at 2010-08-09 20:31:39:
质粒丢失？我做转化时感觉挺好转的啊，平板上张得转化子少，但是基本上都是需要的。

我觉得可能是感受态问题，涂在板上的转化的感受态细胞的菌体很多，但是都没有长出单菌落，好像是成片的死菌一样，偶尔长出来的单菌落鉴定确不是，但是把单菌落挑起来用抗生素培养液摇菌，4~7天后再检测却为阳性，但是继代重新摇又检测不到阳性条带了……
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5楼2010-08-12 08:31:51
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free-fish

铜虫 (正式写手)
★
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我觉得可能是你检测跑PCR的时候酶加少了，所以检测的时候没有目的条带，我曾经也是这样，后面把酶加多了，转化子就跑出目的片段了，而且条带正常
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6楼2010-08-12 09:15:38
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周_yan

木虫 (小有名气)
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Originally posted by tianhang at 2010-08-12 08:29:40:

那么说可能是引物的问题？引物在检测质粒的时候好用，但是由于质粒进入农杆菌后会产生变化？然后引物就不好用了么？请问你后来重新设计的引物与原来的有什么不同？需要在哪些地方改进？谢谢你的帮助哈~祝你试验 ...

我原来设计的引物包含5‘端一些非编码区即在起始密码子之前20多个碱基处开始设计的；后来就直接在起始密码子前设计了，考虑这一段非编码区可能会有影响。不知你的引物是如何设计的？
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7楼2010-08-12 09:37:13
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tianhang

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 周_yan at 2010-08-12 09:37:13:


我原来设计的引物包含5‘端一些非编码区即在起始密码子之前20多个碱基处开始设计的；后来就直接在起始密码子前设计了，考虑这一段非编码区可能会有影响。不知你的引物是如何设计的？

我的引物是直接从起始密码子前面设计的，加上酶切位点，估计没什么可改动的地方了~还是谢谢你
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8楼2010-08-12 10:35:50
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周_yan

木虫 (小有名气)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by tianhang at 2010-08-12 10:35:50:

我的引物是直接从起始密码子前面设计的，加上酶切位点，估计没什么可改动的地方了~还是谢谢你

不过你还可以设计一个不包含酶切位点的引物试一试。
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9楼2010-08-12 14:48:16
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wangyibo8629

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼: Originally posted by 周_yan at 2010-08-10 10:56:09
我前段时间也遇到了同样的问题，总是筛不出带来，感觉总是转不进去；后来我又重新设计了一个引物与原来的不同的引物再筛就行了，发现前面筛的那些都是。可能的原因是转入农杆菌之后原来的引物序列丢失了或者有特殊结 ...

你好，请问什么样的特殊结构可能会影响转化呀？我也遇到一样的问题，我的重组质粒是直接合成的，包括一段启动子序列、一段目的基因序列、一段终止子序列，两端有与载体上同样的两个酶切位点，其中目的基因序列转录的是非编码RNA，会形成一种茎状的结构。重组质粒转化到大肠杆菌中克隆以后，阳性转化子提质粒，之后所提的质粒就没有办法转到农杆菌当中，筛不到菌。请老师指教，非常感谢。
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10楼2015-08-10 22:00:15
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