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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】载体构建，急需，在线等
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可波

银虫 (正式写手)

中正居士

[交流] 【求助/交流】载体构建，急需，在线等 已有5人参与

做连接反应时，除了调节载体片段比例外，还要考虑他们绝对数量的问题。一般载体片段越大，需要的量要大一些。想知道载体片段大小和连接时需用量的对应关系。大家连植物表达载体时一般载体加进去多少，我指的是绝对质量。宝生物论坛上说25ul体系里一般载体要0.03pmol, 换算过来我12K的片段就要加二百多纳克才够用，但我收胶浓度常常是个位数。真的需要加这么多去连吗？
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Entertogrowinwisdom,departtoservebetterthycountryandthykind.
1楼 2010-07-18 09:55:36
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guixiaohua

禁虫 (小有名气)
★
可波(金币+1):我做了体系中小片段约50ng,摩尔比10：1加的连接载体，到现在还没成功 2010-07-18 11:36:00
amisking(金币+1):鼓励一下。 2010-07-18 12:26:51
本帖内容被屏蔽
2楼2010-07-18 10:37:36
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
可波(金币+1):小的片段时做酶切回收的片段。。。快崩溃了 2010-07-18 11:32:37
胶回收浓度怎么会那么低呢？建议将浓度提高
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-07-18 11:22:46
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可波

银虫 (正式写手)

中正居士
体系中，小片段约50ng，按摩尔比10：1加的连接载体量，连接转化没做成功。。。快崩溃了。。。
各位载体构建高手就帮忙指点了
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Entertogrowinwisdom,departtoservebetterthycountryandthykind.
4楼2010-07-18 11:39:14
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-07-18 14:08:35
可波(金币+2):我刚才做了10微升的体系，里面加了50纳克左右insert，分别按10：1和 5:1做了，不知道会咋样，但愿这次能转化成功吧 2010-07-18 14:53:41
小片段回收效率低的话，可以采用酶切后直接乙醇沉淀。
连接时片段和载体比例很重要，但我觉得最重要的还是片段和载体要被酶切完全。
我的经验是100-200ng载体或片段用1uL酶作用，体系可适当放大（20-40 uL体系）。
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Thank-you，so-blue.
5楼2010-07-18 13:04:32
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jqq1985

银虫 (正式写手)
可波(金币+1):此言很蒙。。。还是很感谢 2010-07-19 18:09:44
在我做克隆时不怎么考虑载体与片段的比例关系。2.5kb的载体就取1ug做克隆，片段一般用2管50ul的PCR 条带取来做克隆，基本都成功过。也就是说在片段越多越好。
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6楼2010-07-19 14:09:07
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