| 查看: 11590 | 回复: 49 | |||||
| 【奖励】 本帖被评价31次，作者juanjuanzi增加金币 20.35 个 | |||||
[资源]
【分享】蛋白质纯化个人总结1
|
|||||
|
蛋白质纯化 一．不同纯化技术的原理和标准条件 1、亲和层析（AC） AC对蛋白质进行分离时基于一个蛋白（或者蛋白的一个基团）与层析介质相连的特异性配体之间的可逆性的相互作用而进行的。这种技术适用于捕获或者中间体步骤，并且只要目的蛋白的合适配体是可得的，就可以随时使用这种方法。AC具有高选择性，因此具有高分辨率，并且通常情况下具有高结合能力（对于目的蛋白）。亲和层析通常是作为两步纯化流程中的第一步（捕获步骤）而使用，接下来的第二个层析步骤（抛光步骤）就是要除去剩余的杂质。靶蛋白特异性地、可逆地与一种互补结合物质（配体）相连。在有利于靶蛋白和配体之间特异性结合的条件下上样。不能结合的物质被漂洗下来，而结合上去的靶蛋白通过改变条件以破坏靶蛋白与配体相互结合被回收下来。这种破坏作用是使用一种竞争性配体而特异性地进行的，或者是通过改变pH、离子强度或者极性而非特异性地进行的。样品在与柱材结合时被浓缩，并且以一种纯化的、浓缩的形式被收集起来 2、离子交换层析（IEX） IEX能够高分辨率地分离表面电荷不同的蛋白质，该方法具有较高的样品结合能力。这种分离方法是基于一个带电荷蛋白与带有相反电荷层析介质之间的可逆性相互作用而进行的。上样时，蛋白结合到柱子上。然后改变条件使得结合上去的物质能够差异性洗脱下来。通常通过改变盐浓度或者改变pH来进行洗脱。改变是阶段性或者连续性梯度进行的。最为常用的方式是使用盐（NaCl）浓度梯度洗脱（图A1.2）。靶蛋白在在与柱材结合时被浓缩，并且以一种纯化的、浓缩的形式被收集起来。蛋白质的净表面电荷随周围pH变化而改变。通常情况下，一个蛋白会在大于其等电点（pI）的条件下与阴离子交换树脂结合，而在低于其pI时与阳离子交换树脂结合。但是，应该注意的是，结合依赖于电荷，因此即便是与上述情况相反，表面电荷可能也足以用来结合。通常，IEX用于结合靶分子，但是如果有需要，也用于结合杂质。如图A1.3所示，在不同的pH条件下可以重复进行IEX以除去许多带有不同电荷性质的蛋白质。 3、疏水相互作用层析（HIC） HIC分离疏水性不同的蛋白质。该技术适用于纯化流程的捕获或者中间体步骤。分离是基于一个蛋白与层析介质的疏水表面之间的可逆性相互作用而进行的。使用高离子强度缓冲液可增强相互作用，这使得HIC可以很好地用在硫酸铵沉淀或者在IEX上用高盐洗脱后。上样后，保存在高离子强度缓冲液（例如1.5M硫酸铵）中的样品结合到柱子上。然后改变条件使得结合上去的物质能够差异性洗脱下来。洗脱通常通过降低盐浓度来进行（图A1.5）。改变是阶段性或者连续性地降低盐浓度来进行的。最常使用的洗脱方式是从高到低拉硫酸铵梯度。靶蛋白在在与柱材结合时被浓缩，并且以一种纯化的、浓缩的形式被收集起来。其它的纯化处理包括降低洗脱液极性（乙二醇梯度0－50％），添加chaotropic物质（尿素、盐酸胍）或者去垢剂，改变pH或者温度。 4、分子筛层析（GF） GF分离分子大小不同的蛋白质。该技术适用于样品体积减少时纯化过程中最后的处理步骤 （样品体积显著影响分子筛流速和分辨率）。Samples are eluted isocratically(single buffer, no gradient, Fig A1.7).由于缓冲液成分通常不会影响分辨率，因此可以变换缓冲液以适应样品类型或者进一步纯化、分析或者保存需要。蛋白以一种纯化的、浓缩的形式被收集起来。 5、反相层析（RPC） RPC分离带有不同疏水性质的蛋白质和多肽，是基于它们同层析介质上疏水表面之间的可逆性相互作用而进行。上样后，样品结合到柱材上。然后改变条件使得结合上的物质被差异性地洗脱下来。由于反相柱材的特点，结合通常较强。通过使用有机溶剂和其它添加剂（离子对试剂）可以调控结合能力。洗脱通常可以通过增强有机试剂浓度来实现，最常使用的是乙腈。靶蛋白在在与柱材结合时被浓缩，并且以一种纯化的、浓缩的形式被收集起来。 ÄKTAprime™ plus（图2.1）是一套用于蛋白质纯化的既经济又易于学习的系统。这套系统包括程序化纯化组氨酸标签以及GST标签蛋白的方法。 从线性流速（cm/h）转换成体积流速(ml/min) 体积流速(ml/min)＝线性流速（cm/h）/6×柱横截面面积（cm2） ＝Y/60 × π×d2/4 其中Y＝线性流速（cm/h） d＝柱内径（cm） 实例： 当线性流速是150cm/h时， XK16/70柱子（也就是1.6cm）的体积流速是多少？ Y＝线性流速＝150（cm/h） d＝柱内径＝1.6（cm） 体积流速＝150× π×1.6×1.6/60×4(ml/min) ＝5.03ml/min 从体积流速(ml/min)转换成线性流速（cm/h） 线性流速（cm/h）＝体积流速(ml/min) ×60 /Z×60×4/π×d2 其中 Z＝体积流速(ml/min) d＝柱内径（cm） 实例： 当体积流速是1 ml/min时，Tricorn 5/50 柱子 (也就是 0.5 cm)的线性流速是多少？ Z＝体积流速＝1(ml/min)π d＝柱内径＝0.5（cm） 线性流速＝1×60×4/π×0.5×0.5 cm/h ＝305.6cm/h 二、膜蛋白 膜蛋白质在基础生理过程（如分子转运、信号转导、能量利用以及细胞和组织结构的维护）具有及其重要的作用。天然内膜蛋白质存在于生物膜的脂类环境中，但是目前研究内膜蛋白质的技术是首先把它们分散在水溶液的环境中，目前通常是通过加入去污剂使得内膜蛋白质和脂类在水中形成可溶性的复合物来完成的。膜蛋白质可以分为膜周蛋白质和内膜蛋白质。膜周蛋白质松散地同细胞膜相互作用，当它们从生物膜上解离出来后通常是能够溶于水的。 （1）、亲和标签的使用极大地推动了基于色谱技术的膜蛋白质的表达筛选及纯化。组氨酸标签是膜蛋白质表达和纯化时最常用的标签，GST标签和其它标签也已经成功用于膜蛋白质的表达及纯化。通常我们会在标签和靶蛋白质之间插入一个蛋白酶的酶切位点，用以在对膜蛋白质进一步分析前除去标签。 （2）、6个组氨酸标签是可溶性蛋白质纯化时的标准选择，更长的组氨酸标签（8-10个）通常用于膜蛋白质的表达及纯化，在IMAC色谱纯化过程中，更长的标签能够提高膜蛋白质同色谱基质的结合强度，进而提高其产量。有报导说更长的组氨酸标签（＞6）的使用在某些情况下会导致膜蛋白质的表达水平下降。并且在洗脱时相应的咪唑浓度也应适当提高。 （3）、由于膜蛋白质是通过N端信号肽进行插膜过程的，因此标签一般会置于膜蛋白质的C末端，以保证N端的天然功能。 （4）、如果将荧光蛋白质（如GFP）融合在带有组氨酸标签的膜蛋白质上，会我们更容易监测靶膜蛋白质在表达，溶解及纯化过程中的行为，从而可以加速对这些过程的优化。 1、细胞的收集 细胞收集的方法要依赖于宿主细胞的类型。表达膜蛋白质细胞收集方法和表达细胞内水溶性蛋白质的方法一样，通常使用低速离心机进行细胞收集。 2、细胞的破碎及细胞膜的制备 细胞破碎的方法要依赖于宿主细胞的类别。基本上，用于表达膜蛋白质的细胞破碎的方法和表达可溶性蛋白细胞破碎的方法一样。细胞破碎后会产生含有膜蛋白质的细胞膜/囊泡的悬液。悬液中还含有可溶性蛋白质、未被破碎的完整细胞、细胞碎片及其它物质。在膜蛋白质的纯化过程中首先要将这些杂质除去。目前在细胞破碎后标准的分离细胞膜/囊泡的方法是差速离心法。将离心后收集的细胞重悬于合适的缓冲液（如PBS）中进行细胞破碎。加入Dnase可以降低细胞裂解液的粘度，通常还要加入蛋白酶混合制剂（cocktail）来抑制可能发生的蛋白质降解。 总结了细胞破碎的常用方法及技术。 液体剪切压力：通过将样品从高压腔转入到低压腔时产生的快速压力落差来破碎细胞 超声：通过高频率的声波破碎细胞 玻璃珠磨碎：用玻璃珠的搅动来磨碎细胞 渗透压: 从高渗透压转向低渗透压介质 反复冻融: 通过反复形成冰晶破碎细胞；通常结合酶法裂解下细胞 酶法裂解: 常和其他技术一同使用，如反复冻融或渗透压破碎法；溶菌酶是破碎细菌细胞壁最常用的酶 3、溶解 溶解是整个膜蛋白质制备过程中最关键的步骤。通过溶解过程，用去污剂将膜蛋白质从它们所处的自然环境（脂膜）中提取至水溶性环境。去污剂可以打破脂双层，并将膜蛋白质和脂类包裹进去污剂微胶束中。膜蛋白质的疏水表面和脂类分子的疏水尾部都埋藏在去污剂微胶束的内部，而亲水部分则同水溶液的环境接触（Fig1.1）。去污剂可以有效的打破脂类－膜蛋白质、蛋白质－蛋白质之间的相互作用，因此可以用于蛋白质的分离。在去污剂存在下，任何已知的用于水溶性蛋白质的纯化技术均可用于膜蛋白质的纯化。通过成功的溶解步骤可以得到稳定的蛋白质－去污剂复合物（或蛋白质－脂类－去污剂复合物），并且该蛋白质还要保持其具有活性时的天然构象，产率亦应较高。 [ Last edited by juanjuanzi on 2010-7-9 at 09:53 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘贴专辑推荐
 专业电子书 | 分子生物学 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
球磨分散剂
已经有4人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有291人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 蛋白质纯化凝胶层析
已经有9人回复
- 【资料】蛋白质纯化经验指南-生物秀实验频道总结经验
已经有319人回复
- 蛋白质纯化与鉴定实验指南[l冷泉港]中译本
已经有661人回复
- 蛋白质固定吸附与蛋白质分离纯化的区别
已经有9人回复
- 诚招有分子生物学及蛋白质表达纯化背景的博士一年级同学到美国来做抗体engineering
已经有16人回复
- 硅胶在蛋白质分离纯化中的研究进展
已经有3人回复
- 【求助/交流】有关HIS-tag蛋白质纯化
已经有5人回复
- 【求助/交流】请教一个his-tag蛋白质纯化问题
已经有9人回复
- 【分享】蛋白质纯化个人总结2
已经有38人回复
- 【分享】细胞培养技术个人总结---接上面的2
已经有18人回复
- 【分享】新药研发与生产常见问题与经验心得收集汇总
已经有113人回复
- 【交流/求助】导师给的课题是关于蛋白质分离纯化，做起来很难么？
已经有33人回复
3楼2010-07-09 10:13:22
2楼2010-07-09 10:12:59
4楼2010-07-09 10:30:28
5楼2010-07-09 11:47:30
6楼2010-07-09 14:41:51
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +239 - MolEPI: 46
- 应助: 255 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 17167.1
- 帖子: 6381
- 在线: 2671小时
- 虫号: 856414
7楼2010-07-09 14:54:02
8楼2010-07-12 14:42:48
9楼2010-07-12 15:45:47
10楼2010-07-14 11:48:26
11楼2010-07-24 16:19:12
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +239 - MolEPI: 46
- 应助: 255 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 17167.1
- 帖子: 6381
- 在线: 2671小时
- 虫号: 856414
12楼2010-07-24 23:05:11
13楼2010-07-26 14:29:21
14楼2010-07-26 14:34:46
15楼2010-08-14 16:57:44
16楼2010-08-15 08:26:39
17楼2010-08-15 09:54:07
18楼2010-08-15 10:48:54
19楼2010-08-15 16:21:13
20楼2010-08-17 14:29:31
21楼2010-08-18 18:02:06
22楼2010-08-21 16:38:45
23楼2010-08-21 16:40:56
24楼2010-08-24 14:32:52
25楼2010-08-25 19:06:16
26楼2010-08-26 09:34:23
辛苦了！！27楼2010-08-26 09:57:16
28楼2011-01-09 19:40:55
brightfuture01
木虫之王 (文坛精英)
- MolEPI: 14
- 应助: 23 (小学生)
- 贵宾: 1.2
- 金币: 112652
- 帖子: 28111
- 在线: 3301.8小时
- 虫号: 464575
29楼2011-01-09 21:36:13
30楼2011-04-07 10:30:03
33楼2011-07-13 13:30:03
34楼2011-07-13 14:05:02
35楼2011-07-14 11:19:29
36楼2011-12-16 13:30:08
37楼2012-04-11 14:24:18
38楼2012-05-04 16:24:52
39楼2012-06-06 17:12:50
43楼2013-02-27 21:26:11
44楼2013-02-27 21:26:50
45楼2013-04-10 17:31:46
46楼2014-05-05 19:07:23
47楼2015-07-23 20:40:31
49楼2019-08-24 08:17:57
50楼2019-12-06 16:04:36
简单回复
yudongdong31楼
2011-04-15 19:01
回复
五星好评 谢谢分享！
zlu52032楼
2011-04-21 10:53
回复
三星好评 
止水之殇40楼
2012-06-19 12:20
回复
五星好评 支持
windsor201141楼
2012-08-10 10:55
回复
五星好评 感谢分享
pinger85042842楼
2012-10-10 20:24
回复
五星好评 
508860748楼
2015-10-21 19:36
回复
五星好评 
200