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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白跑胶两条带
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dreamofyou

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】蛋白跑胶两条带 已有4人参与

最近纯化一个蛋白，过完His柱，跑胶出现了两条带，挨得很近，就差10几个氨基酸的样子，再过gel filtration， 还是两条带，每个fraction都是这样，请教各位这是什么原因？是因为降解了吗？什么方法可以避免？因为我需要非常纯的蛋白，谢谢大家~
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1楼 2010-07-02 22:35:00
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dreamofyou

银虫 (小有名气)
这个跑胶的部分实际上只是表达的一部分蛋白，这里称为A吧，大概245个氨基酸长度，有两条带，再表达的另外两批，分别比A少10个氨基酸和20个氨基酸，跑胶就没有两条带了。而且A是同一批培养出来的菌，也是一批纯化的，但是不是同一个菌落，这个会产生这么大的影响吗?而且纯化了两次都是这样的。我就想知道有没有办法可以避免这种现象？
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5楼2010-07-04 17:49:30
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
需要更多的信息，最好有张SDS-PAGE图，这样一目了然
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2楼2010-07-02 23:40:16
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-07-04 10:59:30
首先挨得很近的两条带不要指望分子筛能把他们分开。我的经验告诉我分子量相差10KD一下的分子筛（supdex200）根本分不开。

你的蛋白是不是一批培养出来一次纯化出来的？是否来自于同一个菌落？不同批次纯化出来的蛋白会存在微小差别！蛋白中的二硫键没有充分打开，构象不同，电泳条带也会存在差异。

当然也有你说的降解的因素。
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4楼2010-07-04 10:58:18
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):单克隆是必须的，我也这么做 2010-07-04 22:53:26
引用回帖:
Originally posted by dreamofyou at 2010-07-04 17:49:30:
这个跑胶的部分实际上只是表达的一部分蛋白，这里称为A吧，大概245个氨基酸长度，有两条带，再表达的另外两批，分别比A少10个氨基酸和20个氨基酸，跑胶就没有两条带了。而且A是同一批培养出来的菌，也是一批纯化的 ...

我以前的时候没有这样的感念，认为同一次转化的不同克隆应该没有差别，事实上我分批次纯化出来不同克隆的蛋白SDS-PAGE显示三条条带。
现在我都是挑取一个克隆，然后把它在平板上画线，以后都是用这一个克隆的后代。
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6楼2010-07-04 21:56:13
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