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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因敲除问题
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】基因敲除问题 已有5人参与

做大肠杆菌的基因敲除，将目的基因敲掉了正在做抗性基因的反敲除。将以敲除目的基因的菌在摇管中42度培养保证pKD46丢失后电转如pCP20,做cm抗性基因的反敲除，37度在氨苄板上长菌，再将这些菌转接的另一氨苄板上也长（是不是可以证明pCP20以电转入？），然后将菌分别接入氨苄摇管和LB摇管，其中氨苄摇管37度培养，LB摇管42度培养，从氨苄摇管中提质粒，能提出就是pCP20， 证明pCP20转入了，LB摇管42度培养是为了诱导pCP20中的翻转酶表达并丢失。将于能提出质粒的氨苄摇管对应的菌在转接入氯霉素摇管结果发现也长了，这是为什么呐？按说42度足以是pCP20表达并丢失了但为什么就是反敲除不成功呐？还有，会不会是因为pKD46没有丢失，pCP20转不进去？做过这方便的大侠们请指点啊！谢谢了！！！！
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1楼 2010-06-18 14:39:11
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鹏飞九万里

新虫 (初入文坛)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-18 16:54:51
我倒现在还没有用抗性片段去替代目的基因，更别说后续实验了。。。郁闷啊，lz可以留下联系方式不？想向你请教请教~~~谢了~
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2楼2010-06-18 16:47:25
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lmzxcom1

金虫 (著名写手)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-18 17:13:54
抗生素的用量你把握一下，特别是浓度，因为很多抗生素都不溶水，这个抗性会有假阳性的存在，不能完全说明问题
祝实验顺利
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3楼2010-06-18 17:07:15
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kether

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wwdxx2004 at 2010-06-18 14:39:11:
做大肠杆菌的基因敲除，将目的基因敲掉了正在做抗性基因的反敲除。将以敲除目的基因的菌在摇管中42度培养保证pKD46丢失后电转如pCP20,做cm抗性基因的反敲除，37度在氨苄板上长菌，再将这些菌转接的另一氨苄板上也 ...

我也正在做这一阶段的实验，线性片段电击转化，怎么也不成功啊！
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4楼2010-06-18 20:21:07
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wwdxx2004

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 鹏飞九万里 at 2010-06-18 16:47:25:
我倒现在还没有用抗性片段去替代目的基因，更别说后续实验了。。。郁闷啊，lz可以留下联系方式不？想向你请教请教~~~谢了~

呵呵 我也不知道怎么就电进去了 也是常规方法了 可能是菌不同的缘故吧
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5楼2010-06-18 21:12:34
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大同静逸

银虫 (小有名气)

羡慕

大家做的都这么深入，我还停留在门外没有进来呢。希望看到你们的经验啊！学习。
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共同创造美好未来！
6楼2010-06-22 13:00:14
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