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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案已有10人参与

求助基因克隆方面的问题解决方案

本人正在克隆一个微生物的一个基因，设计简并引物扩增基因组DNA，获得了几个DNA片段，在NCBI里比对，与一些微生物的同源性达到80%以上，我想知道有了这些DNA片段的序列，如何知道相应的氨基酸序列呢？然后如何得到该基因的全长？（已经知道没有内含子）
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1楼2010-05-14 18:11:36
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)
呵呵，我也知道用primer primer 5，但是觉得这个不准确啊，用DNAstar也是一样的感觉。我的研究表明整个基因组内是没有内含子的，但我的目标基因比较大（8KB）左右，目前获得的部分片段也只有800bp左右，所以觉得基因组步移可能比较困难啊 ！！！
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7楼2010-05-15 11:10:58
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-14 21:16:19
feitianrenwo(金币+3): 2010-05-15 09:44:05
feitianrenwo(金币+1): 2010-05-16 09:44:38
有了DNA序列如何知道相应的aa氨基酸序列？翻译啊，无论是什么序列，只要是功能基因，那么只有一个阅读框是正确的，你可以正向反向翻译，去掉一个碱基再翻译，去掉两个碱基再翻译，在翻译中不中断的序列即是正确的阅读框，拿翻译的结果去做蛋白质blast
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2楼2010-05-14 19:57:24
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-14 21:16:28
feitianrenwo(金币+3): 2010-05-15 09:44:14
feitianrenwo(金币+1): 2010-05-16 09:44:35
首先楼主要说明白，获得的片段是从头到尾的，还是只是一部分，就是说楼主要说明白引物是怎么设计的，在什么位置设计的，明确这一点的目的是要知道是否包含完整的阅读框。

如果楼主PCR所用引物比较靠近两端，就是说基本能包含完整的阅读框，那么直接使用NCBI的ORF fineder就可以了，可以直接找到整个开放阅读框，并且翻译出氨基酸序列，包含起始密码子和终止密码子
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3楼2010-05-14 20:39:21
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)
我是根据保守的氨基酸序列设计的简并引物，对基因组DNA扩增获得了一些片段，但是经ORF的finder搜索并没有发现开放阅读框。

我的意思是如何通过这些DNA的序列知道相应的氨基酸序列，然后就是通过什么方法获得基因的全长
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4楼2010-05-15 09:52:57
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