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along8998

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】克隆5k片段 已有8人参与

各位大侠好,我要克隆一个5k左右的片段,GORK基因,现在犹豫不知道直接克隆还是分段克隆好,不知哪个大侠做过类似的长序列克隆,希望能给小弟一些指点和建议。
非常感谢!!
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呵呵
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风中摇曳

木虫 (正式写手)

热爱科学

★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-16 22:03
你可以用TAKARA公司的LA taq酶,它能扩增长片段,建议不要用普通的taq酶扩增。我最近刚通过LA taq酶得到一个4K左右的片段。
scienceisnature
2楼2010-04-16 22:02:08
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zrm1983

银虫 (小有名气)

★ ★
lstt09nk(金币+2):欢迎交流~~ 2010-04-17 19:22
楼上的方法可以,takara的LAtaq酶挺好用的,我克隆过12K的片段,不过要注意选一个扩增长片段稳定的PCR仪,那样效果比较好。
3楼2010-04-17 09:43:18
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

建议先分两段扩增,然后再做overlap PCR
4楼2010-04-17 11:54:31
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

我最近用NEB公司 的Phusion超保真DNA聚合酶扩增长片段效果极佳,不妨一试。货号:F-530s。网址;www.neb-china.com
5楼2010-04-26 12:28:22
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wdongdong

金虫 (小有名气)

用东洋纺的KOD-PLUS也是很好的酶,我克隆的是4kb很好用
6楼2010-04-29 20:59:06
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gandalf886

银虫 (小有名气)

takara的LA taq还是算了吧,5kb估计满是突变,下游实验没法用。
KOD plus不错。takara的primer star也行
7楼2010-04-29 21:06:05
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liyong1981

金虫 (正式写手)


建议分段做,一次做突变多,到时候更麻烦~
8楼2010-04-30 10:11:11
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huaq1984

银虫 (初入文坛)

直接扩就好了,有Takara的LAtaq就可以,只要体系没问题应该好扩
9楼2010-05-04 13:38:39
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

可以用transgene的fast pfu, 专门用来扩增长片段的  保真效率很高  而且扩增效率很高 至少可以到达2kb/min吧   扩长片段我们实验室一般都是用这个。感觉还可以 ,但不知道对于你的实验合不合适
10楼2010-05-04 13:55:51
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