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runxiaoli木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】构建载体出现的问题，请各位高手给予帮助已有8人参与
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各位大侠： 大家好，我最近在做载体构建，经过连接转化后挑菌，进行菌液PCR，对跑出目的条带的菌液进行质粒提取，并进行质粒PCR，也有带。可是进行双酶切的时候出现问题，所有的质粒酶切后经电泳检测皆只有一条带，无目的条带。送出菌液测序，无信号。 该载体构建实验持续2个月，期间换了好几次载体与目的片段的连接比例，都是遇到以上的情况，深切期待大家的帮忙，不胜感激。期待您的帮助。 |
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雪山飞狐7233
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11楼2010-04-18 08:52:22
saturn100
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scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-15 11:55
runxiaoli(金币+1): 2010-04-15 20:54
runxiaoli(金币+1):你好，我用一个载体上的引物与我的下游引物进行质粒pcr，结果跑出的目的条带大小一致。酶切依然无结果。您觉得这种情况应该怎么办。 2010-04-15 20:55
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-15 11:55
runxiaoli(金币+1): 2010-04-15 20:54
runxiaoli(金币+1):你好，我用一个载体上的引物与我的下游引物进行质粒pcr，结果跑出的目的条带大小一致。酶切依然无结果。您觉得这种情况应该怎么办。 2010-04-15 20:55
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检测目的片段的时候尽量不要用PCR，污染几率太高，而且就算你获得片段了，你没有测序，如何确认你的PCR产物就是目的片段， 双酶切一般比较可靠，不过之后也要进行测序的，你的结果只能说明一个问题，没有目的片段的插入， 重新换个连接酶（好的试剂盒）试试吧！ |
2楼2010-04-14 20:20:30
yujiaping1
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3楼2010-04-14 20:24:25
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4楼2010-04-15 11:07:27