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[交流] 国外糖尿病分子实验研究信息

国外糖尿病分子实验研究信息

随着糖尿病发病率明显上升和发病人数的显著增加，尤其在欧美发达国家，已经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后第三位威胁人类健康的疾病，引起国内外广大学者及有关部门的高度重视。目前国外对糖尿病防治的研究涉及到许多方面，如临床流行病学、相关病因学、遗传与环境因素、发病机理、疾病诊断和治疗方法、糖尿病教育管理、糖尿病急慢性并发症和胰岛素抵抗等方面研究，研究的内容多种多样，文献报道相当丰富，研究结果令人振奋。由于本章篇幅有限，不能将上述内容一一赘述，由于目前国外实验研究的重点之一是胰岛素抵抗和慢性并发症，以下就有关胰岛素抵抗和糖尿病慢性并发症的分子学发病机制等相关内容的国外目前研究结果作一简单介绍，以为人们研究参考，其他相关内容可见有关章节。
一·胰岛素抵抗发病的分子学机制实验研究现状：
胰岛素抵抗（IR）不仅是2型糖尿病的主要病因之一，也是高血压、冠心病、动脉粥样硬化等并发症产生的原因之一。根据目前许多研究结果表明，胰岛素抵抗的发病机制未能完全明了，但基本上一致认为，IR的产生与遗传因素和环境共同作用的结果，而就目前已知的环境因素仅能解释不到三分之一的IR的成因，故多数学者认为遗传因素可能是IR发病的主要成因，如Pederson等提出IR是多种基因一定数量的突变遗传所致[1]。以下就目前有关IR发病的相关基因和作用机制作一简单的介绍。
1·胰岛素信号传递系统中的相关基因及其缺陷的研究：
目前在胰岛素信号系统中相关基因研究中，胰岛素受体（INSR）、胰岛素受体底物系列（IRSs）、及其下游的PI-3激酶（PI-3K）系统的障碍为近年研究IR发病的主攻方向[2-3]。
在胰岛素受体（INSR）基因的研究中，由于INSR是胰岛素作用的第一个步骤，因此INSR基因是研究IR发病机制的最早工作方向，自1988年发现该基因第一个突变后，至今已发现有50余种突变，这些研究大多在2型糖尿病患者人群中进行的，有关实验研究的报道很少。INSR基因突变大致分为五种：⑴突变致使基因完全消失或部分消失，导致mRNA转录提前终止或减少。⑵裂解位点突变导致mRNA翻译后修饰障碍，影响受体分子结构，从而阻碍其向细胞膜的转运。⑶突变受体结构改变可导致受体与胰岛素的亲和力降低。⑷抑制受体中酪氨酸激酶活性的突变，原因可能是突变受体与正常受体竞争底物，从而抑制了正常受体的活性，⑸因突变可减少胰岛素受体的再循环和加速受体的降解，使细胞膜上的INSR数量减少。这些部分已为动物实验所证实，如INSR去基因鼠在宫内发育正常，但出生后很快可出现酮症酸中毒；肝特异性INSR去基因鼠，可致严重的IR、高胰岛素血症、ICT及对外源性胰岛素的抵抗。但现在研究结果证明INSR基因突变多为伴随极度IR的遗传综合征，而不是导致目前临床2型糖尿病中常见IR的主要发病因素[4-5]。
因此目前的研究主要集中在胰岛素受体底物系列（IRSs）、及其下游的PI-3激酶（PI-3K）系统上。在IRSs的具体研究中，Joslin糖尿病中心的Kahn和white等学者自1991年开展研究以来，取得了显著的成绩，已发现IRSs成员6个，其中以IRS-1和IRS-2研究比较深入，他们采用去基因（knock out）小鼠研究发现：IRS-1去基因（IRS-1-/-）小鼠的PI-3K活性降低，IRS-2表达及其磷酸化代偿性增加，伴IGT，肌肉、脂肪细胞IR以及对胰岛素样生长因子-1（IGF-1）抵抗而致生长滞顿，若腹腔内注射葡萄糖会产生糖耐量损伤；IRS-2去基因（IRS-2-/-）小鼠出现中度或严重IR，同时伴早期β细胞功能衰竭，出现糖尿病。IRS-3去基因/IRS-4去基因小鼠则无上述异常变化[6-7]；Almind等经转染试验证明，IRS-1基因突变可显著降低胰岛素刺激的磷脂酰肌醇-3（PI-3）激酶（PI-3K）活性，减少与PI-3K亚基结合的IRS-1数量，而导致IR的产生，其中PI-3K属蛋白激酶，可特异性地磷酸化肌醇磷脂3位羟基，由P85和P110两个亚基结合，前者可和IRS特异性结合，后者具有酶的活性，当P85和IRS结合后，P110经磷酸化激活蛋白激酶B（PKB），使糖摄取、糖原和蛋白质合成增加，从而产生糖耐量降低和糖利用减少[8-9]。这些研究结果表明，IRS作为细胞内糖蛋白，是胰岛素信息传递的重要介质，通过PI-3K活性的改变，与IR发病有密切关系。
2·与物质代谢有关的基因缺陷的研究：
目前主要研究内容涉及到β-3肾上腺能受体（β3AR）、糖原合成酶（GS）、特异性蛋白磷酸酶1调节亚单位3（PPP1R3）和脂肪酸结合蛋白2（FABP2）等基因的变异。β3AR主要分布于脂肪组织，尤其是棕色脂肪组织，主要作用是介导脂肪分解和热量生成，Klein等研究结果表明，β3AR与胰岛素信号系统间存在着相互作用，在交感神经过度兴奋状态下，用β3AR激动剂预刺激β3AR可减低INSR、IRS-1、IRS-2的酪氨酸磷酸化及与IRS-1相关的PK-3R的活性，产生IR[10]；Walston等研究结果显示，β3AR基因出现错变，可引发β3AR受体信号传导障碍，导致脂肪组织分解和热生成作用减弱，成为肥胖、IR和2型糖尿病的发病原因之一[11]。GS是糖原合成中的一个限速酶，目前许多研究表明，由于IR的主要发病机制与葡萄糖进入非有氧氧化途径受阻，特别是肌糖原合成受阻有关，因此糖原合成酶（GYS1）基因被认为与肌肉组织IR密切相关，Melander等用转染试验分别对GYS1基因中四种错义突变基因进行表达并检测了其合成酶的活性，仅发现其中一种变异（Pro442Ala）突变所合成的GYS1酶活性明显下降，可能与IR有关[12]。PPP1R3主要作用是通过是糖原合成酶脱磷酸化激活刺激糖原合成的途径来调节肌糖原的合成与分解，一般认为PPP1R3基因被认为是遗传性IR的候选基因，Hansen等发现PPP1R3基因突变（Asp→Tyr）可使糖原合成受阻而致IR[13]；Xia等发现PPP1R3基因的多态性变异（ARE2）可导致PPP1R3mRNA的降解加速，PPP1R3生成减少，肌肉中糖原合成受阻而导致IR[14]。FABP2是小肠粘膜上的转运蛋白，与小肠游离脂肪酸吸收、血浆游离脂肪酸浓度及脂质氧化等有关，FABP2基因变异可改变FABP2的亲和力，导致葡萄糖氧化、利用和糖原合成的抑制，从而引起肥胖和IR，这在Baier等的研究中已得到证实[15]。
3·其他相关基因缺陷的研究：
对于IR发病相关基因的研究，目前研究较多的有肿瘤坏死因子-α（TNF-α）基因、浆细胞膜分化抗原1（PC-1）基因和过氧化物酶增殖物激活受体（PPARs）等。许多实验证明TNF-α可干扰周围组织胰岛素作用而导致IR，伴有IR的肥胖啮齿类动物和人类肥胖者脂肪组织TNF-α基因均呈过度表达，Qi等在动物实验中发现去TNF-α基因（TNF-α-/-）肥胖小鼠的胰岛素敏感性（IS）明显高于TNF-α+/+肥胖小鼠，表明TNF-α参与IR的形成，其作用途径可能有三条，使IRS-1丝氨酸磷酸化抑制了INSR酪氨酸激酶的活性、增加血FFA浓度而干扰了周围葡萄糖的摄取和抑制脂肪细胞葡萄糖转运体4（GLUT4）的表达而致脂肪细胞摄取葡萄糖受到抑制[16]。PC-1属Ⅱ类膜糖蛋白，是从2型糖尿病病人成纤维细胞中分离出的一种具有抑制INSR酪氨酸激酶活性的糖蛋白，在伴有IR的病人骨骼肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞中均发现PC-1过度表达，cDNA转染试验也表明，PC-1过度表达可抑制胰岛素信号的传递而致IR[17]。PPARs属2型核受体超家族成员，是一类由配体激活的核转录因子，有三种亚型（α、β和γ），其中PPARγ与脂肪细胞分化、肥胖和IR关系密切，已成为近来研究的重点，PPARγ是诱导脂肪细胞分化的特异性转录因子，同时又是胰岛素增敏剂TZDs作用的靶分子，两者结合可发挥降低血糖血脂和提高胰岛素敏感性（IS）的作用，研究表明PPARγ基因突变可引起体重及IS的改变[18]。
二·糖尿病慢性并发症发病的分子机制：
糖尿病慢性并发症是糖尿病的主要危害，机体长期处于高血糖水平可广泛累及心、脑、肾、眼、神经系统及皮肤等器官组织，产生如糖尿病性心血管、肾病、视网膜、神经等慢性并发症的病变。无论是1型还是2型糖尿病，引起慢性并发症的发病机制基本上是各种血管病变（血管并发症），其主要致病因素主要由于高血糖毒性作用，在2型糖尿病除此之外部分是由于高脂血症和高胰岛素血症等。综合目前国外对此研究报导，高血糖导致血管并发症的分子致病机制主要有四种假说，多元醇通路增多假说、蛋白激酶C活化（DAG-PAC活化）假说、非酶促蛋白糖基化假说和氧化应激假说，以下有关这四种假说的目前研究状况作一介绍。
1·多元醇通路增多假说：
多元醇通路增多假说最早提出，近年来的大量研究结果显示，多元醇通路（PP）激活是糖尿病慢性并发症（DCC）的重要发生机制之一，一般认为PP激活产生大量山梨醇，使组织细胞发生渗透性肿胀，肌醇和K+丢失，细胞Na+-K+ ATPase活性下降，导致组织细胞代谢和功能损害。
但是最近研究表明，PP激活可能是DCC发病机制诸多因素的“始动因素”，还参与了蛋白非酶糖基化、氧化应激、蛋白激酶C活化等与DCC有关的生化、病理过程，PP参与高血糖引起血管并发症的致病机制也与其始动因素有关。当PP激活时，可产生大量的3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG），3-DG也是终末糖基化产物（AGEs），即Amodori衍生产物，Chie等研究表明，3-DG具有自身的生物学活性，它能诱导表皮生长因子生长，参与血管内皮细胞的生长，与动脉粥样硬化的发生有关[19]。作为终末糖基化产物（AGEs）的3-DG，可以产生大量的活性自用基（主要为羟基和超氧阴离子），并使机体抗氧化能力下降，从而导致血管兵变[20]，这也为Lee等用转基因动物过度表达AR研究所证实，发现晶状体中GSH明显降低和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）明显增加，这也说明PP与氧化应激反应有关[21]。PP激活后可致二酰甘油（DAG）的合成增加，DAG是经典型PKC和新型PKC异构体的重要内源性激活物，而PKC是体内众多血管活性物质和细胞因子的共同信号传导途径，可以引起多种血管病变，Ishii等用ARI阻断了高血糖介导的PKC激活[22]，Keogh等用HOE-843（一种ARI）显著降低DM大鼠肾脏系膜细胞DAG水平，并抑制了PKC激活[23]。此外，PP激活可通过影响一氧化氮和一氧化氮合成酶的生成而致血管病变的产生，Okuda等观察到高糖环境中人脐静脉内皮细胞山梨醇水平明显升高，NO生成减少，用NON-2235（一种ARI）后上述指标呈明显反向改变[24]。
2·蛋白激酶C活化（DAG-PAC活化）假说：
众所周知，蛋白激酶C（PKC）是细胞内信息传递过程中的一个关键酶，而血糖浓度增高可产生大量的二酰甘油（DAG），DAG是体内最主要的内源性激活剂。Ishii等在活体和离体动物实验中证明，在高血糖环境下各种血管细胞内DAG水平及PKC活性均缓慢和持久的增加[25]，Xia等发现用PKC和cPla2的特异抑制剂可阻止高血糖诱导的Na+-K+ ATPase的活性下降，此酶活性下降可影响血管细胞的完整性及收缩、生长、分化功能[26]。PKC活化后可通过激活转录因子-活化蛋白-1（AP-1）来调控多种蛋白质的基因表达，Aielo等在提外实验中发现高血糖环境下，毛细血管外膜细胞及动脉血管平滑肌细胞中钙调蛋白基因表达家少，在mRNA水平观察到用PKC抑制剂可阻止这种减少，钙调蛋白是一种血管收缩蛋白，有促进血管收缩和减少血管通透性的作用，此外PKC活化还可使基因表达纤维蛋白连接素、胶原Ⅳ增加，促进细胞外基质蛋白的合成和积聚[27]。PKC活化还可使血浆纤溶酶原激活物抑制因子基因表达增加，促进内皮细胞产生von Willebrnd因子，血小板活性增高[28]。Muniyappa等通过离体实验，在血管平滑肌细胞中观察到PKC活化使诱导型NO和酶的表达及NO的产生减少[29]，最近发现在高血糖培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞中肾上腺髓质素（AM）mRNA水平增加，同时伴有PKC活性的增加，AM是一种具有血管扩张作用的多肽物质，AM的增加是通过PKC活化途径的，用PKC抑制剂可阻断以上两者的增加[30]。Martinze等在动物实验中发现，注射AM可是糖尿病大鼠的血糖升高，而注射AM抗体使血糖水平下降[31]。Xia等在动物实验中用PKC抑制剂阻断了有高血糖诱导的血管细胞功能失调，从另一侧面证明了PKC活化在糖尿病血管并发症发生发展中具有重要作用[26]。
3·非酶促蛋白糖基化假说：
如上所述，非酶促蛋白糖基化在糖尿病血管并发症中的作用，主要是终末糖基化产物（AGEs）的3-DG的作用。离体实验发现血管内皮细胞处于高血糖状态培养1周后，其内AGEs含量就增加了13.8倍[32]，N-羧甲基-L-赖氨酸是另一种糖化蛋白的氧化产物，可聚集在动脉粥样硬化的血小板、泡沫细胞中，可导致肾脏血管硬化[33]。AGEs与血管内皮细胞中AGEs特异受体（AGER）结合可增加细胞内氧化应激水平，对氧自由基敏感的核转录因子（NF-κB）被激活，使IL-1、IGF-1等产生增多，可增加血管通透性，增加前凝血质活性，使粘附分子表达增加，单核细胞移入血管内膜增多、作用增强而造成血管壁损伤[34]。
4·氧化应激反应假说：
氧化应激反应假说在糖尿病血管并发症中的作用目前尚有争议，从以上论述中可见，其可能不是一个独立的高血糖毒性作用机制，而是前三个假说的作用环节之一。如实验发现向血管内皮细胞培养液中加入AGE前30分钟预先加入抗氧化剂来减少氧化应激反应，结果显示NF-κB的活化受到抑制[35]。在动物实验中补充维生素E可减少氧化应激水平，尤其是低密度脂蛋白（LDL）的氧化，而氧化LDL能诱导巨噬细胞转变为泡沫细胞，引起动脉粥样硬化的形成[36]。
虽然目前将一氧化氮（NO）及其合酶（NOS）与糖尿病及其血管并发症的关系归属于氧化应激反应中，但近来大量研究结果表明上述许多因素可通过NO、NOS和NOS基因的变化产生糖尿病微血管并发症，可能是前三个假说的作用环节之。糖尿病微血管并发症早期，由于iNOS生成过量NO，通过细胞毒与细胞抑制作用参与并发症的损伤机制，如肾小球高滤过状态、血流加速、血管通透性增高、血管内膜损伤等；在糖尿病微血管并发症晚期，由于AGE、自由基等促NO灭活因素、NOS活性异常使NO含量减少，cNOS生成NO减少，使NO的扩张血管、调节血压、抑制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等作用减弱，导致NO对糖尿病微血管并发症的保护作用减弱[37-38]。如体外实验证实，1型和2型糖尿病大鼠的血管中NO合成减少，对乙酰胆碱诱导的血管舒张功能减弱，而提供外源性NO后可使血管舒张功能改善[39]，链脲佐菌素（STZ）诱导的2型糖尿病大鼠肾病发生与NO有关，早期肾小球滤过率、肾血浆流量升高，鸟NO2、NO3排泄量增加，NOS抑制剂L-NAME后上述指标均下降[40]。动物实验中发现，高血糖条件下，视网膜血管内皮细胞中eNOS基因活性下降，同时在临床中发现2型糖尿病患者血小板中eNOS基因活性也下降[41。另外国外目前研究多集中在eNOS基因突变或多态性与原发性高血压和冠心病等心血管病变的关系上，而与糖尿病微血管并发症的关系研究较少，仅将糖尿病作为相关因素或危险因素研究。

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