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【专题】PCR添加剂简介 已有1人参与
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1.3 PCR添加剂研究概述 PCR添加剂是PCR反应中的一种增效剂，它们在PCR反应中起到提高PCR反应的特异性、增加PCR扩增的产量及防止无效扩增等有益效果。由于PCR技术在有些情况下扩增的不完美性，从PCR技术发明的初期开始，人们就展开了对PCR反应中添加其它化学物质的研究。迄今为止，在PCR添加剂的研究领域，人们已经发现了越来越多的PCR添加剂，它们都以各自的特性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。而随着PCR添加剂研究的不断发展，在各种相关研究中，人们逐渐从研究和应用单一型PCR添加剂转向研究和应用复合型PCR添加剂，从传统PCR添加剂的研究开发转向新材料新化合物PCR添加剂的研究开发。 传统的PCR添加剂包括常见的助溶剂、离子化和非离子化的除垢剂以及一些诸如氯化四甲基铵（TMAC）、甜菜碱、SSB等。多年来人们对这些添加剂的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些PCR有着增效作用，但在另外一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作用，所以这些PCR添加剂的在不同反应体系中的应用应通过试验来调整和合理选择，合理准确的使用会使PCR反应获得很大的改善，从而得到试验所需要的理想结果。 甜菜碱是一种高效的甲基受体，它在一些细菌体内对抵抗因盐份引起的渗透压升高起着重要的作用，其做为一种PCR添加剂，出现在Rees.W.A.[22]等人对甜菜碱降低DNA 的Tm所做的研究之后。甜菜碱广泛存在于多种酶以及PCR试剂盒中，它能提高PCR扩增的效率和特异性，特别是在长PCR（Long-PCR）扩增时常被应用[23]。Barnes[23]指出，在Long－PCR中添加甜菜碱能够使每个循环的热变性温度下降到92℃～93℃，且退火温度也可以下降1℃～2℃，从而补偿因退火条件变化及因其它添加剂引起的酶稳定性下降引起的PCR反应的负面效果。另外，他还指出甜菜碱不仅能促进高GC含量片段的扩增，而且能提高普通的PCR扩增的目的产物量[24]。甜菜碱另外一个优点是，作为一种渗透保护剂，它具有和牛血清白蛋白（BSA）类似的功能，能够防止聚合酶的变性[24]。把Long－PCR Buffer中的BSA换成甜菜碱将有利于减少弥散问题的发生。甜菜碱也有可以克服DNA少量污染带来的扩增困难，这意味着PCR反应可以在低质量模板存在的情况下进行[25]。 氯化四甲基铵（TMAC）最早被用于在杂交反应中减少DNA／RNA的错配以提高特异性[26]，在PCR反应中，它能够增加PCR反应的效率和提高PCR反应的特异性。在Ted Hung等人[27]首次发现TMAC提高PCR反应特异性的研究中，他们选择了两个mouse cDNA的基因片段进行扩增实验。结果显示，含有1×10-5～1×10-4 M TMAC的实验组扩增结果在电泳图上只出现一条单一的目的条带，而未含有TMAC的实验组特异性非常差，有多条非目的条带出现。Eric Chevet等人[28]在研究中还发现，通过添加TMAC可以提高AT含量丰富的DNA片段的Tm，从而通过改善引物的特异性结合来提高PCR反应的特异性。在研究中，他们实验了不同浓度的TMAC促进PCR反应的效果，发现TMAC的最佳添加浓度为60mM。他们的研究还表明，TMAC不仅可以提高PCR反应的特异性，而且可以提高PCR反应的效率，三对引物的扩增实验均发现添加TMAC可以提高PCR目的产物产量5～10倍。 单链结合蛋白（SSB）是活的生物体中不可缺少的重要物质，它非特异性的和单链DNA结合，参与所有涉及到单链DNA的诸如复制，修复及重组等过程[29]。这种体内DNA复制过程中SSB所起到的重要作用，自然引起了人们对SSB在PCR这一体外DNA 复制技术中应用的可行性考虑。Rapley等人[30]在1994年首次就SSB在PCR中的应用做了专门研究。他们研究发现T4噬菌体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应均有提高效率的作用。由于PCR反应是一个不断的热循环过程，因此嗜热源SSB是PCR添加剂的理想来源，这一点在近年来的研究中得到了证实。Dąbrowski等[12]就曾克隆Thermus aquaticus 和 T.thermophilus的SSB编码基因并让它们在E. coli中过表达，随后进行的Taq SSB及Th SSB在PCR中的添加实验表明它们均能很好的提高PCR反应效率。之后不久，Perales等人[13]表达纯化了三种类型ThSSB，在Th聚合酶和Pfu聚合酶的PCR体系中所做的实验发现ThSSB可以使PCR延伸的时间减半，而且在无校正功能的Th聚合酶PCR体系中的实验进一步表明ThSSB可以增加PCR反应的保真度。而Olszewski等人[14]在multiplex PCR 实验中对TaqSSB的研究发现其可以防止或减少引物二聚体的形成，从而有效提高PCR反应的效率和特异性。 甲酰胺（Formamide）是被较早发现并广泛应用的PCR添加剂之一，它能显著性的提高PCR反应的特异性[8]。为了开发新的更高效的PCR增效剂，Raj Charabarti等人[31]对与甲酰胺结构类似的低分子量的胺类化合物在PCR中的应用做了专门的研究。在Raj Charabarti等人的研究中，包括甲酰胺在内的与甲酰胺结构类似的共四大类10种低分子量胺类化合物做了PCR反应添加实验。实验结果表明，acetamide对中等GC含量的片段扩增有非常好的效果，而对高GC含量的片段却并不是这样；2-pyrolidone对多数基因片段都有特别好的增强扩增的效果，特别是在高GC含量的扩增中表现除很好的效果。 DMSO是也是一种较早被发现的且广泛应用的PCR增效剂。P.R.Winship[5]、B.Bachmann[32]等较早对DMSO在PCR产物测序中能有效降低DNA链的复性做过报道，随后D. Pomp[33]，G. Sarkar[8], Filichkin.S.A.[34]及Sun Y[35]等人对DMSO在PCR中的应用做了进一步的研究，虽然他们的报道中都指出DMSO能够全部或部分的提高PCR反应的特异性，但各自报道的有效作用浓度都有很大差别，添加量从0.9％到15％不等，过高浓度的DMSO均能抑制PCR反应。肖志壮[36]等人就过量DMSO抑制PCR反应及降低PCR扩增的特异性的现象在所实验的PCR模型上做过专门的研究并提出了应对的策略，他们的研究表明，在10 %DMSO 的反应体系中，引物浓度为7. 5 ×10 - 7mol/ L 时，模板浓度提高到1. 6×10 - 10mol/ L即可完全避免非特异扩增。值得注意的是，10 %DMSO存在时，如果引物浓度降低至7. 5 ×10 - 8mol/ L，则看不到特异产物，也就是说，反应体系含DMSO时，需增加引物浓度，保证PCR特异扩增。因此，DMSO用于PCR时一定要注意平衡模板、引物及DMSO的浓度，这一点值得我们在应用DMSO的PCR实验中加以注意。 鉴于DMSO在优化PCR反应中所起的效果且同样为了开发新的更高效的PCR添加剂，Raj Charabarti等人[37]还对其它几种水溶性亚砜类化合物在PCR中的应用做了相应的研究，以期判断它们是否也具有同样的优化PCR反应的效果。在实验中，他们选用了三种高GC模板PCR模型，就DMSO、methyl sec-butyl sulfoxide, n-propyl sulfoxide, n-butyl sulfoxide, and tetramethylene sulfoxide 等五种亚砜类化合物优化PCR反应的分别做了测试。在这五种测试的亚砜类化合物中，methyl sec-butyl sulfoxide为唯一一种分子结构呈不对称性的化合物，tetramethylene sulfoxide为唯一一种分子结构含环形功能团的化合物。在三种高GC模板模型中，牛脑GTP cDNA（660bp, 58%GC）模板为主要受测模型，所有五种亚砜类化合物首先在这个模型上进行测试。结果表明，除添加n-butyl sulfoxide的实验组未出现任何目的产物外，其它四种被测化合物均有表现出很强的提高PCR反应特异性的效果，且对应得到目的产物均有很高的产量。具体效果效果为：tetramethylene sulfoxide为效果最佳，methyl sec-butyl sulfoxide次之，接下来是n-propyl sulfoxide，DMSO以其只能获得所有产物中89％的特异性产物而居最后。在产量上，添加tetramethylene sulfoxide，methyl sec-butyl sulfoxide及n-propyl sulfoxide后的实验组为添加DMSO实验组的2～3倍多。而在接下的来实验中，对剩下四种化合物，同样以牛脑GTP cDNA（660bp, 58%GC）模板为模型实验了的各种化合物的有效作用浓度范围，实验结果表明，tetramethylene sulfoxide的有效作用浓度范围为：0.28～1.0M，methyl sec-butyl sulfoxide的有效作用浓度范围为：0.03～0.31M，n-propyl sulfoxide的有效作用浓度范围为：0.15～0.36M，DMSO的有效作用浓度范围为：0.75～1.25M。在996bp人骨髓白细胞c-jun cDNA ( 64%GC)模型上所做的进一步测试表明，变性温度为95℃时，tetramethylene sulfoxide相比于DMSO有较好的作用效果，而propyl sulfoxide相比于DMSO则效果较差；变性温度为92℃时，tetramethylene sulfoxide则为唯一有效的添加剂。而在511bp人PSM cDNA(52%GC, 158bp 73% GC 片段)模型上的测试再一次证明tetramethylene sulfoxide为最有效的添加剂，DMSO次之，propyl sulfoxide居最后。和作者稍早前基于相同的出发点对系列砜类化合物作为PCR添加剂所做研究的结果对比分析可知[38]，虽然methyl sulfone比DMSO的效果稍好，但亚砜类化合物总体来说作用效果要好于砜类化合物。作者进一步的比较分析指出，这种在PCR反应中不同亚砜类化合物间所表现出的不同效果是有一定的化学式上的结构依赖性的，同比来说环状结构的砜类、亚砜类及胺类化合物作用效果明显优于其它结构的化合物。有研究者认为DMSO提高PCR反应的特异性是由于其于模板DNA的大沟和小沟结合并破坏其双链结构，在这里，作者认为环状结构化合物的独特作用效果可能是由于其破坏了模板DNA大沟和小沟里带有供体和受体互补氢键的理想构象，也有可能其通过限制DNA链的自由旋转而使得DNA骨架的相邻基团间位间排斥减小。 新型高效是以上从结构类似化合物中筛选新PCR添加剂的出发点，近年来，复合型PCR添加剂的开发更是朝这各目标又迈进了一步。所谓的复合型添加剂就是把两种或两种以上的PCR添加剂通过一定的比例混合在一起形成的新型PCR添加剂，和单一PCR添加剂相比，其促进PCR的效率更高。N. Baskaran 等人[39]的报道中，实验了四种不同的片段的PCR，其中两个高GC片段（64％和80％），两个非高GC片段（44％和52％）。当在同一个体系中同时扩增四个片段时，实验表明1.0M的甜菜碱结合6％～8％DMSO及5％DMSO结合1.2～1.8M的甜菜碱能很好的同时扩增出四种目的片段，虽然高浓度的DMSO及高浓度的甜菜碱在也能扩增出某种或某几种片段，但四种目的片段的产量均衡性比不上甜菜碱和DMSO组成的复合型添加剂。最近，J. Kang等人[7]在随机序列DNA文库的同步PCR扩增试验中也同样发现1M的甜菜碱结合5％DMSO能改善PCR扩增的效果。相比于以上两种PCR添加剂组成的简单复合型添加剂，M. Ralser等人[40]及M. Musso等人[41]则相继报道了三种以上PCR添加剂组成的复合型添加剂。Markus Ralser等人对其混合配置形成的含有甜菜碱，DMSO，DTT及BSA四种物质的复合型添加剂在12对引物(GC含量61％～75％)扩增实验中进行了测试，结果发现最佳的复合型添加剂配比如下（30ul体系中终浓度）：0.54M甜菜碱、1.34MDTT、1.34％DMSO及11ug/mlBSA。在这一最佳配比下可以获得最好的PCR扩增特异性和最高的PCR扩增产量。他们的实验结果还表明，这种配比的PCR增效剂同比于Qiagen，Invitrogen及Bioline等品牌的商品化PCR增效剂在PCR增效效果上是相当，而且和各种不同的DNA聚合酶及各种不同的模板均具有很好的兼容性。稍后，M. Musso等人应用1.3M甜菜碱，50uM 7-deaza-dGTP及5％DMSO混合而成的复合型添加剂高产量扩增了GC含量为79％的长度为392bp的DNA片段，接下来在另外两段DNA片段（GC含量为67.8％和72.7％）的扩增中这种复合型PCR添加剂同样能帮助获得高特异性的扩增产物。 近年来，和复合型PCR添加剂一样，新化合物及新材料PCR添加剂的研究开发是PCR添加剂研究的新方向。海藻糖、homoectoine、Zn2+–1,7-bis(4-quinolylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (Zn2+–Q2-cyclen)、单壁碳纳米管（SWNTs）及纳米金胶体等数种新PCR添加剂被人们研究和发现。这其中，纳米材料的应用具有重要的意义，它开辟了PCR添加剂研究的新天地。 海藻糖是一种一种非还原性二糖，是由两个分子的D-葡萄糖单元通过α,α-1,1糖苷键连接而成。和甜菜碱的效果类似，它能够帮助有机体抵抗干燥，脱水，热，冷和氧化等外在因素的干扰。海藻糖最早见于cDNA合成反应中的应用，在反应中其能显著的提高酶的热稳定性[42]。A. N. Spiess等[43]报道过其在PCR反应中的应用，他们的研究指出海藻糖能很好的促进高GC含量片段的扩增。在由Real-Time PCR仪器软件所给出的曲线图上，清楚的显示出在一定的浓度范围内随着海藻糖浓度的增加PCR反应效率也不断增加。仅当海藻糖的浓度大于0.6M时PCR的反应效率才有所下降。为了说明海藻糖对Taq酶的热稳定性的影响，在Taq酶进入PCR反应前，他们在95℃下对含有0.2M的海藻糖及不含海藻糖的Taq酶进行了30分钟和90分钟的保温实验。保温是在标准的PCR反应的Buffer中进行的，这样可以保证和真实PCR反应的环境相一致。在接下来的实验中，用这种保温后的Taq酶进行PCR扩增。结果显示，添加海藻糖的Taq酶在保温30分钟后同比于未添加海藻糖的Taq酶其热稳定性只有微弱的增加，但是在保温90分钟后同比却有很大的增加。在文中，作者还比较了海藻糖和甜菜碱的效果，结果表明一定浓度的甜菜碱虽然具有和海藻糖相似的增加PCR反应效率的效果，但海藻糖的有效作用浓度范围比甜菜碱要大，这就说明海藻糖在应用上比甜菜碱会更方便。 Homoectoine是一种由L-ectoine衍生合成而得到的一种新化合物M. Schnoor等人[44]在比较了Betain(甜菜碱)，β-hydroxyectoine，L-ectoine及homoectoine等四种化合物后发现homoectoine降低DNA Tm值的效果是所有四种物质中最强的。在随后的PCR反应添加实验中，他们发现相比于甜菜碱更低浓度的homoectoine就能达到和甜菜碱相似的特异性扩增效果。 Zn2+–cyclen（cyclen= 1,4,7,10-tetraazacyclododecane）是一种大环四胺锌复合物，有研究发现，当溶液中解离常数为0.3mM、pH为8.0时能选择性的和dT结合[45]。因而当大环四胺锌复合物与双链DNA结合时，其与dT的选择性结合可以削弱A-T碱基对间的氢键，从而引起了DNA的Tm值的下降。Zn2+–Q2-cyclen是Zn2+–cyclen的衍生物，E.Kituta等人[46]发现由于其在喹啉环和nucleobase之间多出了两个π-π键的堆积作用，从而和dT的结合比Zn2+–cyclen要更紧密（Kd＝10uM，pH8.0）。他们小组的E. Kinoshita等人[47]在后来的进一步研究中发现，对于完全配对的短寡核苷酸双链（homoduplex）和不完全配对（一个碱基错配）的寡核苷酸双链（heteroduplex），Zn2+–Q2-cyclen降低heteroduplex的Tm值能力更强，数据显示在Zn2+–Q2-cyclen浓度超过5uM时heteroduplex的Tm变得几乎很难测量到。文中的数据还显示，这种独特的降低Tm值的现象在其它几种常见的具有降低Tm值特性的PCR添加剂中却没有观察到。这个结果提示我们，Zn2+–Q2-cyclen具有防止引物错配的明显优点，因此也就可以用来在低效PCR的扩增中提高特异性。他们就这个问题在同一篇报道中做了相应的研究，结果表明以基因组DNA及cDNA文库为模板进行的PCR扩增中均能看到Zn2+–Q2-cyclen提高PCR特异性的效果，而最佳的Zn2+–Q2-cyclen添加浓度是和体系中的模板DNA及引物的量是相关的。 碳纳米管（CNTs）又称纳米碳管，是一种新型的纳米材料，它是由日本科学家于1991年首先发现[48]。按其壁包含碳原子层的多少可以分为单壁碳管（SWNTs），双壁碳管（DWNTs）及多壁碳管（MWNTs）。CNTs的直径为几个纳米到几十个纳米不等。碳纳米管的应用领域十分广泛，具有巨大的商业价值：其高强度的特性使它可以作为超细高强度纤维，也可作为复合增强材料；其独特的电学性能，使其可用于多种半导体器件，如场效应晶体管、二极管、逻辑电路等，甚至大规模集成电路[49]。在生物技术领域，碳纳米管可作为纳米药物载体，亦可见作为纳米生物传感器得到应用[50,51]。迄今为止，碳纳米管做为添加剂在PCR中的应用仅见一篇文献报道。D. Cui等人[52]的对SWNTs做为PCR添加剂的研究表明，在浓度低于3μg/ul时随SWNTs浓度的增加PCR产物的产量逐渐提高，但当浓度大于3μg/ul时产量却受到抑制。PCR体系不含Mg2+时也同样观察到相似的结果。 胶体金做为PCR添加剂，由上海交通大学H. Li等人[15]首先发现并在Angew. Chem. Int. Ed.上进行了报道，他们发现直径为10nm的纳米金颗粒在一定浓度范围内能显著提高PCR反应的特异性。结果显示在添加金纳米颗粒后，电泳图上与目的片段DNA相对应的地方仅出现一条显著性的条带，而未添加金纳米颗粒的电泳图上则显示明显的拖尾现象。在进一步对浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8及1.0nM的纳米颗粒添加后所得产物的电泳图进行比较后得出，从0.2nM依次到0.8nM，PCR反应的特异性逐渐提高，但当反应体系中存在过多的金纳米颗粒（1.0nM）时，PCR反应会被有力地抑制，产物的量明显降低。他们还对比研究了分别在25℃，30℃，35℃，40℃下退火时添加金纳米颗粒前后产物的电泳图，结果显示，同一温度下，金纳米颗粒添加前后图谱中条带形成了鲜明地对比，即使在25℃的较低温度下退火，添加金纳米颗粒后都显示出了非常好的特异性。之后不久，与Haikuo Li等人发现胶体金显著提高PCR特异性不同，台湾的研究人员Min Li等人[16]则发现胶体金具有提高PCR反应灵敏度的特性。他们在研究中发现，在保证相同或更高的扩增产量的情况下，添加直径为7nm～13nm的纳米金颗粒可以使PCR反应的时间缩短。通过不同的PCR系统、不同的DNA聚合酶及不同的模DNA的PCR添加实验后发现，对于慢速PCR仪通过添加纳米金颗粒可以提高PCR灵敏度5～10倍，而在快速PCR仪上这一数值可以提高到104。 从以上的报道可以知道，纳米材料做为新型的PCR增效剂不仅可以增加PCR特异性和效率，而且可以提高PCR反应的灵敏度。这是迄今为止其它类型的PCR所无法比拟的。 |
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不错，长见识了。曾经看到文献中一个PCR体系中加DMSO，一直不解。。。 
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