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raul_fowler

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于甲烷氧化菌的PCR问题

请问大家用的是什么引物啊,体系如何。
我的体系是25ul,PCR buffer 12.5,DNTP10,引物各2.5,酶0.125,其余水补足。
用巢氏PCR,第一步总是P不出来,
第一步引物是27f-methT2R和methT1dF-methT1bR
有没有什么好办法啊,急啊!!
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 2010-03-03 23:38
首先请确定你的PCR体系,你提供的几样东西,加起来已经超过25ul,请问再用水如何补足???另外你所以试剂的浓度都不给出,如何让大家帮你看体系是否正确
第二,之所以使用巢式PCR,就是因为第一步扩增可能太少,很难观测到结果,所以大可不必在第一步PCR的结果上费心思
第三,做第二步PCR时,一般要对第一步的PCR产物适当稀释,我们通常在不稀释和100倍之间可以P出来
2楼2010-03-03 13:00:40
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by raul_fowler at 2010-03-03 09:51:57:
请问大家用的是什么引物啊,体系如何。
我的体系是25ul,PCR buffer 12.5,DNTP10,引物各2.5,酶0.125,其余水补足。
用巢氏PCR,第一步总是P不出来,
第一步引物是27f-methT2R和methT1dF-methT1bR
有没有什么好 ...

第一次发帖,体系是笔误。。。,把总体系写上了。
10*PCR BUFFER是2.5ul,DNTP是2ul,酶是0.125(5U/ul),引物配成20uM,各加加2.5ul,其余用水补足
试剂是都TAKARA的试剂,实验室PCR基本都用这个体系,别的P得也很好,就是甲烷氧化菌这总P不出来,望大侠指教。
3楼2010-03-03 15:22:58
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)

第一步看不到条带也算正常吗?
4楼2010-03-03 15:24:36
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)

模板是试剂盒纯化过的土壤DNA,每次加1ul,各种稀释度也做过,就是没条带
5楼2010-03-03 15:26:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by raul_fowler at 2010-03-03 15:24:36:
第一步看不到条带也算正常吗?

第一步看不到条带,对于巢式PCR来说完全正常,如果第一步直接有结果,有的时候第二步就不需要做了,我们在做病毒鉴定的时候通常都是这样做的
6楼2010-03-03 15:39:35
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