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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于甲烷氧化菌的PCR问题
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于甲烷氧化菌的PCR问题

请问大家用的是什么引物啊，体系如何。
我的体系是25ul,PCR buffer 12.5,DNTP10,引物各2.5，酶0.125，其余水补足。
用巢氏PCR,第一步总是P不出来，
第一步引物是27f-methT2R和methT1dF-methT1bR
有没有什么好办法啊，急啊！！
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1楼 2010-03-03 09:51:57
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 2010-03-03 23:38
首先请确定你的PCR体系，你提供的几样东西，加起来已经超过25ul，请问再用水如何补足？？？另外你所以试剂的浓度都不给出，如何让大家帮你看体系是否正确
第二，之所以使用巢式PCR，就是因为第一步扩增可能太少，很难观测到结果，所以大可不必在第一步PCR的结果上费心思
第三，做第二步PCR时，一般要对第一步的PCR产物适当稀释，我们通常在不稀释和100倍之间可以P出来
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2楼2010-03-03 13:00:40
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by raul_fowler at 2010-03-03 09:51:57:
请问大家用的是什么引物啊，体系如何。
我的体系是25ul,PCR buffer 12.5,DNTP10,引物各2.5，酶0.125，其余水补足。
用巢氏PCR,第一步总是P不出来，
第一步引物是27f-methT2R和methT1dF-methT1bR
有没有什么好 ...

第一次发帖，体系是笔误。。。,把总体系写上了。
10*PCR BUFFER是2.5ul，DNTP是2ul，酶是0.125（5U/ul），引物配成20uM,各加加2.5ul，其余用水补足
试剂是都TAKARA的试剂，实验室PCR基本都用这个体系，别的P得也很好，就是甲烷氧化菌这总P不出来，望大侠指教。
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3楼2010-03-03 15:22:58
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)
第一步看不到条带也算正常吗？
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4楼2010-03-03 15:24:36
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raul_fowler

新虫 (初入文坛)
模板是试剂盒纯化过的土壤DNA，每次加1ul,各种稀释度也做过，就是没条带
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5楼2010-03-03 15:26:32
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by raul_fowler at 2010-03-03 15:24:36:
第一步看不到条带也算正常吗？

第一步看不到条带，对于巢式PCR来说完全正常，如果第一步直接有结果，有的时候第二步就不需要做了，我们在做病毒鉴定的时候通常都是这样做的
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6楼2010-03-03 15:39:35
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