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raul_fowler

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[交流] 【求助/交流】关于甲烷氧化菌的PCR问题

请问大家用的是什么引物啊，体系如何。
我的体系是25ul,PCR buffer 12.5,DNTP10,引物各2.5，酶0.125，其余水补足。
用巢氏PCR,第一步总是P不出来，
第一步引物是27f-methT2R和methT1dF-methT1bR
有没有什么好办法啊，急啊！！

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1楼 2010-03-03 09:51:57

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yujiaping1

木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+2): 2010-03-03 23:38

首先请确定你的PCR体系，你提供的几样东西，加起来已经超过25ul，请问再用水如何补足？？？另外你所以试剂的浓度都不给出，如何让大家帮你看体系是否正确
第二，之所以使用巢式PCR，就是因为第一步扩增可能太少，很难观测到结果，所以大可不必在第一步PCR的结果上费心思
第三，做第二步PCR时，一般要对第一步的PCR产物适当稀释，我们通常在不稀释和100倍之间可以P出来

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2楼2010-03-03 13:00:40

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raul_fowler

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引用回帖:

Originally posted by raul_fowler at 2010-03-03 09:51:57:
请问大家用的是什么引物啊，体系如何。
我的体系是25ul,PCR buffer 12.5,DNTP10,引物各2.5，酶0.125，其余水补足。
用巢氏PCR,第一步总是P不出来，
第一步引物是27f-methT2R和methT1dF-methT1bR
有没有什么好 ...

第一次发帖，体系是笔误。。。,把总体系写上了。
10*PCR BUFFER是2.5ul，DNTP是2ul，酶是0.125（5U/ul），引物配成20uM,各加加2.5ul，其余用水补足
试剂是都TAKARA的试剂，实验室PCR基本都用这个体系，别的P得也很好，就是甲烷氧化菌这总P不出来，望大侠指教。

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3楼2010-03-03 15:22:58

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