Originally posted by jasco at 2010-02-09 16:49:06:
1)        通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因，找出保守序列
其实没有必要找所有物种的啦，相近的就可以了，毕竟主要目的就是先得到一段序列
2)        通过保守序列设计引物，使用PCR的方法，克隆出一个 ...

Originally posted by liujiahui at 2010-02-11 15:15:30:
同意jasco的话，建议把第一条给为：估算完成这些实验需要多少时间。

我们化生老师上课的时候讲过的：研究生拿到课题先要估算自己能不能做完。我自己也不明白你做的东西。

  

Originally posted by gyesang at 2010-02-09 22:51:57:
1)        通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因，找出保守序列
你先需要找到葡萄属的所有种的ALDH蛋白序列，然后做一个序列比对。但问题是，所有葡萄属的蛋白序列如何找到呢？这个问题你可以去钻研钻研，这 ...

Originally posted by gyesang at 2010-02-09 22:51:57:
1)        通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因，找出保守序列
你先需要找到葡萄属的所有种的ALDH蛋白序列，然后做一个序列比对。但问题是，所有葡萄属的蛋白序列如何找到呢？这个问题你可以去钻研钻研，这里我给你找好了，你直接去这个网页，然后再钻研钻研：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi，如果你钻研后还不知道如何获得一整个属的蛋白序列，写站内信给我
2)        通过保守序列设计引物，使用PCR的方法，克隆出一个片段，测序。
这里要设计简并引物，如何设简并引物呢？去查阅相关资料，如果搞不明白的话，给我写站内信
3)        根据所克隆片段的序列设计引物，通过RACE的方法，得出序列的3 和5 末端，从而得出ALDH的全长，测序

4)        用RT-PCR的方法，研究ALDH基因在不同组织和时间的表达情况
对，可以做组织表达谱研究，进一步你可以做突变体研究

5)        制备ALDH多克隆抗体，进行Western，验证ALDH酶的在不同时间和组织的表达情况
你先查查看有没有其他物种ALDH的商业抗体可买，很多抗体有发生交叉反应的，所以你不必自己去制备抗体，毕竟自己制备抗体实在太麻烦，你这个是酶，你制备抗体实际意义不是太大，没有必要，你可以制备突变体，然后看葡萄的表型，或者你可以通过测定酶活力，你这个是酶，你应该跟酶活力的研究结合起来，而不是从蛋白表达水平入手
6)              在逆境条件下，RT-RCR和western  的方法，对ALDH基因和ALDH酶 在不同组织和不同时间的表达情况进行研究
RT-PCR和测定酶活力的方法足够了，没有必要做WB
7)        对ALDH进行功能性研究

Originally posted by amilie030312 at 2010-02-11 17:00:24:

不过还有些地方是不需要那么麻烦的。
第一条里面NCBI找序列就行了，序列对比软件我建议你用BioEdit，我觉得蛮好用的。
第二条，我觉得兼并引物并不一定好用的，而且普通的RT-PCR还好，如果做的是定量就最好用 ...