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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


yucheng9255(金币+1):谢谢参与
查葡萄属的ALDH蛋白直接在uniprot查就行,不用ncbi的
11楼2010-02-11 08:57:46
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

查葡萄属的ALDH蛋白直接在uniprot查就行,不用ncbi的
12楼2010-02-11 08:58:15
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liujiahui

木虫 (著名写手)


yucheng9255(金币+1):谢谢参与
同意jasco的话,建议把第一条给为:估算完成这些实验需要多少时间。

我们化生老师上课的时候讲过的:研究生拿到课题先要估算自己能不能做完。我自己也不明白你做的东西。
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-02-09 16:49:06:
1)        通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因,找出保守序列
其实没有必要找所有物种的啦,相近的就可以了,毕竟主要目的就是先得到一段序列
2)        通过保守序列设计引物,使用PCR的方法,克隆出一个 ...

13楼2010-02-11 15:15:30
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yucheng9255

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by liujiahui at 2010-02-11 15:15:30:
同意jasco的话,建议把第一条给为:估算完成这些实验需要多少时间。

我们化生老师上课的时候讲过的:研究生拿到课题先要估算自己能不能做完。我自己也不明白你做的东西。

  



谢谢13楼liujiahui的建议,我现在也在考虑自己这个课题要花多长时间才能完成,由于自己现在还算是个生物方面的初学者,还希望有经验的虫虫们多多指点
14楼2010-02-11 16:30:36
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amilie030312

金虫 (正式写手)


yucheng9255(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by gyesang at 2010-02-09 22:51:57:
1)        通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因,找出保守序列
你先需要找到葡萄属的所有种的ALDH蛋白序列,然后做一个序列比对。但问题是,所有葡萄属的蛋白序列如何找到呢?这个问题你可以去钻研钻研,这 ...

这个人很牛
15楼2010-02-11 16:48:01
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amilie030312

金虫 (正式写手)

yucheng9255(金币+5):谢谢你的指点 2010-02-11 21:06
引用回帖:
Originally posted by gyesang at 2010-02-09 22:51:57:
1)        通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因,找出保守序列
你先需要找到葡萄属的所有种的ALDH蛋白序列,然后做一个序列比对。但问题是,所有葡萄属的蛋白序列如何找到呢?这个问题你可以去钻研钻研,这里我给你找好了,你直接去这个网页,然后再钻研钻研:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi,如果你钻研后还不知道如何获得一整个属的蛋白序列,写站内信给我
2)        通过保守序列设计引物,使用PCR的方法,克隆出一个片段,测序。
这里要设计简并引物,如何设简并引物呢?去查阅相关资料,如果搞不明白的话,给我写站内信
3)        根据所克隆片段的序列设计引物,通过RACE的方法,得出序列的3 和5 末端,从而得出ALDH的全长,测序

4)        用RT-PCR的方法,研究ALDH基因在不同组织和时间的表达情况
对,可以做组织表达谱研究,进一步你可以做突变体研究

5)        制备ALDH多克隆抗体,进行Western,验证ALDH酶的在不同时间和组织的表达情况
你先查查看有没有其他物种ALDH的商业抗体可买,很多抗体有发生交叉反应的,所以你不必自己去制备抗体,毕竟自己制备抗体实在太麻烦,你这个是酶,你制备抗体实际意义不是太大,没有必要,你可以制备突变体,然后看葡萄的表型,或者你可以通过测定酶活力,你这个是酶,你应该跟酶活力的研究结合起来,而不是从蛋白表达水平入手
6)              在逆境条件下,RT-RCR和western  的方法,对ALDH基因和ALDH酶 在不同组织和不同时间的表达情况进行研究
RT-PCR和测定酶活力的方法足够了,没有必要做WB
7)        对ALDH进行功能性研究

不过还有些地方是不需要那么麻烦的。
第一条里面NCBI找序列就行了,序列对比软件我建议你用BioEdit,我觉得蛮好用的。
第二条,我觉得兼并引物并不一定好用的,而且普通的RT-PCR还好,如果做的是定量就最好用TaqMan的方法,染料法不是很好。兼并引物还存在扩增效率下降的问题和可能出现假阳性的问题,这一步必须使用RT-PCR,只做DNA样本的PCR是不够的。引物设计软件建议使用Primer3和Primer5搭配使用,先用Primer设计出引物,再用NCBI上的BLIST搜索一下检查特异性,再用Primer看一下引物的质量,应该就没啥问题了。
第三条没啥,做RACE就行,不过现在做RACE的人越来越少了,买个好的RACE盒子吧,否则够你受的。
第四条,做定量吧,做普通的RT-PCR看表达量现在发文章应该不认可的。
第五条,如果没抗体你做RNA的原位杂交或者ViewRNA吧。
第六条,牛人说的对,没必要做WB。
第七条,这光功能分析就足够一篇论文了吧,你咋功能分析啊,做RNAi还是做蛋白方面的实验啊
16楼2010-02-11 17:00:24
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yucheng9255

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-02-11 17:00:24:

不过还有些地方是不需要那么麻烦的。
第一条里面NCBI找序列就行了,序列对比软件我建议你用BioEdit,我觉得蛮好用的。
第二条,我觉得兼并引物并不一定好用的,而且普通的RT-PCR还好,如果做的是定量就最好用 ...

第二条中我做的只是普通的RT-PCR,我想根据数据库中已经测序的ALDH基因确定保守序列,然后根据保守序列设计引物,利用普通的RT-PCR克隆出基因来,至于简并引物是10楼的gyesang给我提出的建议,他(她)建议我查出ALDH蛋白的序列,而不是基因的序列,然后根据蛋白的保守区域设计简并引物,然后提取RNA,进行RT-PCR,克隆基因。
第五条中,我之所以做了RNA在不同时间和不同组织的表达分析,还要做蛋白质在不同组织和不同时间的分析,是因为mRNA的表达情况和蛋白的翻译情况可能会有差异,我想看看二者的表达情况是否一致。你建议的RNA的原位杂交或者ViewRNA,我不是很在行,不清楚是否可以,我下去查资料看看吧
第七条,主要是我现在硕博连读,老板想让我多发几篇paper,现在我也没什么头绪怎么对酶的功能进行分析,但我觉得这个课题要想研究完整的话,这方面工作还是要做的,如果可以单独发一篇paper,我也可以分开发

总之,谢谢你的指点,我的金币也不多,只能给你5个了,希望以后多多交流。

[ Last edited by yucheng9255 on 2010-2-11 at 21:26 ]
17楼2010-02-11 21:24:36
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我是懒人

铁虫 (初入文坛)

yucheng9255(金币+2):谢谢指点 2010-02-12 08:48
我给你的建议是:实验室用来做的,不是用来写流程图的。

设计一个大概的实验思路,然后一步一步的开始解决。

从最初的开始,先克隆出序列再考虑下面的。光这最简单的第一步都有可能耗去你很长一段时间。然后有问题可以一个一个得po上来寻求大家的帮忙。

等你读了一定量的文章后自然而然会知道自己想做什么,需要做什么了。

希望你的实验一切顺利!
18楼2010-02-12 05:16:53
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amilie030312

金虫 (正式写手)

yucheng9255(金币+2):谢谢了 amilie 2010-02-12 15:41
硕博连读搞这么多还可以接受,想发好文章给你个建议,不能光靠实验做的深入,必须联系到实际当中,不然空洞的实验要做到极其高的水平才能被杂志认可,但稍微联系到了实际之后能够马上应用的,或者没有人做过的,比较奇特的很容易就被杂志看重。再有,你想是一码事,做又是另一码事,既然是硕博连读就不需要太着急的开展实验,一定在前期把该学的学好了,把该查的查好了,能为你后续的实验节省不少时间和金钱。
19楼2010-02-12 08:54:16
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xiao精灵

金虫 (小有名气)

嗯,8错8错~~
20楼2010-03-11 22:40:29
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