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yucheng9255木虫 (著名写手)
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[交流]
【专题】希望大家对我的实验思路提出宝贵意见
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老板让我研究野生葡萄中的ALDH基因的表达和功能性分析，该葡萄品种中ALDH基因还没人研究过， 以下是我的实验思路： 1) 通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因，找出保守序列 2) 通过保守序列设计引物，使用PCR的方法，克隆出一个片段，测序。 3) 根据所克隆片段的序列设计引物，通过RACE的方法，得出序列的3 和5 末端，从而得出ALDH的全长，测序 4) 用RT-PCR的方法，研究ALDH基因在不同组织和时间的表达情况 5) 制备ALDH多克隆抗体，进行Western，验证ALDH酶的在不同时间和组织的表达情况 6) 在逆境条件下，RT-RCR和western 的方法，对ALDH基因和ALDH酶 在不同组织和不同时间的表达情况进行研究 7) 对ALDH进行功能性研究 这种思路正确吗？还有怎么查出所有的ALDH基因？如何找出它们的保守序列？怎么对酶进行功能性研究？希望大家提出宝贵的意见！ 谢谢！！！  |
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gyesang
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yucheng9255(金币+1):谢谢参与
yucheng9255(金币+5):真是太感谢你了 2010-02-10 08:06
yucheng9255(金币+1):谢谢参与
yucheng9255(金币+5):真是太感谢你了 2010-02-10 08:06
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1) 通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因，找出保守序列 你先需要找到葡萄属的所有种的ALDH蛋白序列，然后做一个序列比对。但问题是，所有葡萄属的蛋白序列如何找到呢？这个问题你可以去钻研钻研，这里我给你找好了，你直接去这个网页，然后再钻研钻研：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi，如果你钻研后还不知道如何获得一整个属的蛋白序列，写站内信给我 2) 通过保守序列设计引物，使用PCR的方法，克隆出一个片段，测序。 这里要设计简并引物，如何设简并引物呢？去查阅相关资料，如果搞不明白的话，给我写站内信 3) 根据所克隆片段的序列设计引物，通过RACE的方法，得出序列的3 和5 末端，从而得出ALDH的全长，测序 4) 用RT-PCR的方法，研究ALDH基因在不同组织和时间的表达情况 对，可以做组织表达谱研究，进一步你可以做突变体研究 5) 制备ALDH多克隆抗体，进行Western，验证ALDH酶的在不同时间和组织的表达情况 你先查查看有没有其他物种ALDH的商业抗体可买，很多抗体有发生交叉反应的，所以你不必自己去制备抗体，毕竟自己制备抗体实在太麻烦，你这个是酶，你制备抗体实际意义不是太大，没有必要，你可以制备突变体，然后看葡萄的表型，或者你可以通过测定酶活力，你这个是酶，你应该跟酶活力的研究结合起来，而不是从蛋白表达水平入手 6) 在逆境条件下，RT-RCR和western 的方法，对ALDH基因和ALDH酶 在不同组织和不同时间的表达情况进行研究 RT-PCR和测定酶活力的方法足够了，没有必要做WB 7) 对ALDH进行功能性研究 |
10楼2010-02-09 22:51:57
3楼2010-02-09 16:41:56
yucheng9255(金币+5):真是谢谢了 2010-02-09 17:31
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1) 通过生物信息学查找所有生物中的ALDH 基因，找出保守序列 其实没有必要找所有物种的啦，相近的就可以了，毕竟主要目的就是先得到一段序列 2) 通过保守序列设计引物，使用PCR的方法，克隆出一个片段，测序。 最好用RT-pcr啦，转录本水平做 3) 根据所克隆片段的序列设计引物，通过RACE的方法，得出序列的3 和5 末端，从而得出ALDH的全长，测序 4) 用RT-PCR的方法，研究ALDH基因在不同组织和时间的表达情况 Qpcr 5) 制备ALDH多克隆抗体，进行Western，验证ALDH酶的在不同时间和组织的表达情况 是表达蛋白还是用多肽做？ 表达蛋白的话，又要增加一个步骤了。。。 6) 在逆境条件下，RT-RCR和western 的方法，对ALDH基因和ALDH酶 在不同组织和不同时间的表达情况进行研究 7) 对ALDH进行功能性研究 这一套做下来，，，，好几年过去了 |
4楼2010-02-09 16:49:06
yucheng9255
木虫 (著名写手)
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5楼2010-02-09 17:30:24