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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNA变性PAGE电泳
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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】DNA变性PAGE电泳

如题，有哪位好心人能把变性电泳的配方及操作发一份给我，看了文献，发现有N多不同版本，我的目的是验证一下我的引物是否为单一条带！不甚感激，10个金币奉上！
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1楼 2010-01-22 17:30:10
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陈思容

铜虫 (正式写手)
加了6Xloading buffer 啊，不知道为什么会飘
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9楼2010-01-23 10:47:31
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陈思容

铜虫 (正式写手)
我自己先顶下，别沉了！
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2楼2010-01-22 18:47:09
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
陈思容(金币+5,VIP+0): 1-22 19:54
1949stone(金币+3): 1-23 10:19
我有个非变性胶的，我觉得实现你的目的，非变性胶就可以了，变性胶太麻烦，发给你吧
8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体步骤如下：
1.        30%胶的配置。称量290 g丙烯酰胺，10 g N,N’-甲叉双丙烯酰胺，定容至1L，配置成为30%的胶母液。避光短期保存在4 °C冰箱。
2.        5TBE的配置。称量54 g Tris碱，27.5 g硼酸，20 ml 0.5 mmol/L EDTA (pH=8.0)，定容至1 L，配置成5 TBE。4 °C冰箱短期保存。
3.        8%胶的配置。量取80 ml 30%的胶母液，60 ml 5TBE，157.5 ml H2O，配成约8%胶溶液(制胶时，加入TEMED和过硫酸铵后浓度恰好为8%)，4 °C冰箱保存不超过一周。
4.        胶的制作。
1)        使用北京六一电泳仪厂生产的DYCZ-24B型电泳仪标准配件。将清洗干净的平板(规格为130×180 mm)、耳朵板和三个边条，用长耳夹固定好，水平放好。
2)        取配置好的约8%的胶溶液30 ml，同时加入30 μl TEMED和210 μl 10%的过硫酸铵(APS)(过硫酸铵溶液不可长期使用，要经常重新配置)迅速摇匀(尽量不要摇出气泡，尤其是小气泡)，立即灌胶。
3)        将固定好的两片玻璃板微微倾斜，缓慢灌胶，注意观察不要有气泡，如果灌入气泡，可轻轻敲击或者增大玻璃板倾斜角度，使气泡上浮。
4)        胶溶液灌满后，将玻璃板水平放好，插入配套的39齿长城齿梳子，大约30-60 min胶即可聚合(不同室温条件，速度略有差别，一般室温较高速度较快)。
5.        预电泳。配置750 ml 1 TBE倒入电泳槽下部槽中，将凝好的胶板去掉夹子和底部边条，从一端放入电泳液中，以便排净两玻璃板间的气泡(如果两玻璃板底部留有气泡，就会使该位置泳道内的样本迁移速率较周围慢，使电泳条带弯曲)，然后用长耳夹固定好胶板，在上层槽中倒入剩下的电泳液，垂直向上拔出梳子。然后在160 V电压下预电泳30 min。
6.        电泳。预电泳结束后，取混合好6× Loading buffer的PCR产物5 μl，从胶孔中央缓慢垂直点入。注意不要碰到旁边的梳子胶条，这是防止跑出的条带在碰胶一边拖尾现象的出现。并且点样时，不点最边上的两个胶孔，这是因为靠近边条的泳道会使条带向上翘起，造成结果的不准确。点样结束后，在两边各点上1 μl标准分子量(本研究采用的是11道的Marker，1500 bp，1000 bp，900 bp，…，100 bp)。然后在140V电压下电泳3 h左右(可根据产物带的位置调整时间)。
2.3.1.5 银染
参考(Dinesh et al., 1995)等的银染方法，对聚丙烯酰胺凝胶进行染色。具体操作如下：
1.        清洗。将两块玻璃板分开，将胶滑入去离子水中，清洗一下。
2.        染色。倒掉去离子水，加入0.1%的AgNO3溶液，将整个胶片没过即可(容器底部较平，只需要极少的AgNO3溶液)，放到摇床上，缓慢摇荡10 min即可。
3.        清洗。用大量去离子水快速清洗掉胶表面的AgNO3溶液。
4.        显色。倒掉去离子水，迅速倒入新配的显色液(5 g NaOH，0.1 gNaCO3，2.5 ml 37%的甲醛溶液，定容至250 ml)，迅速放到摇床上摇荡，至条带清晰后用自来水冲净显色液。
5.        用凝胶成像系统拍摄或扫描胶片即可。
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3楼2010-01-22 19:48:28
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
陈思容(金币+5,VIP+0): 1-22 19:55
1949stone(金币+3): 1-23 10:19
变性胶也找到一个，我用过这个配方，没有问题
▲凝胶制备
①清洗玻璃板:用自来水、洗涤剂、海绵充分擦洗玻璃板，大量自来水冲净玻璃
板，再用蒸馏水冲洗以去除自来水中的离子。玻璃板斜靠晾干后，
取100%酒精擦洗两遍，之后同样用擦镜纸在耳板上涂lml剥离硅烷
用擦镜纸沾
(RePel
silane，2%)，大板上涂lml亲和硅烷(Bindingsilane0.5%)。操作过程中防
止两块玻璃板互相污染。硅烷涂抹均匀后放置5一10分钟，待其充分干燥。
0.5%亲和硅烷配制方法:
ddHZO:
冰醋酸:
goul
IOul
无水乙醇:1900ul
Bind一silane:IOul
②待玻璃板彻底干燥后组装电泳槽。
③凝胶制备:
胶的配制:
A.40%丙烯酞胺贮备液(丙烯酞胺:双甲叉丙烯酞胺=19:1)
丙烯酞胺95刀克
双甲叉丙烯酞胺5刀克
加ddHZO到250毫升，加热到37Co溶解，4Co保存。
B.6%丙烯酞胺使用液(100毫升)
40%丙烯酞胺贮备液巧毫升
尿素42克
5又TBE20毫升
加ddHZO到100毫升，37Co溶解，过滤。4Co短期保存。
在100毫升6%丙烯酞胺溶液里加入过硫酸按(AP)s400贝，TEMED50贝，摇匀
后立即灌胶。
④灌胶:用注射器抽取100ml已混合好的丙烯酞胺溶液，由注射孔轻轻灌进，防止
出现气泡。待胶流动到胶板上部时，在上部轻轻插入梳子(反插)，使其凝聚
45
秦艳杰海湾扇贝遗传图谱构建及壳色基因、生长相关QTL的定位研究博士学位论文
至少hl以上(室温下)。
▲电泳
①预电泳:取Z000mll又TBE缓冲液，其中600ml加入正极槽中，1200ml预热
至60℃，加入负极槽，拔出梳子。1IOW恒功率预电泳30mni.，使温度达到50
℃。
②电泳:吸吹加样槽，以清除点样孔的气泡及废胶，插入梳子，将变性后置于冰
上的PCR产物一一点入点样孔中，点样量5一7ul。点样过程尽量迅速完成，之后
85w恒功率电泳约Zh。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Binding
Silane的玻璃板上。
▲银染
①固定:将凝胶板(胶已沾于其上)置于ZL冰醋酸溶液(10%)中，轻轻摇荡直至
颜色褪净为止，一般需要25一30分钟;
②漂洗:用ZL蒸馏水漂洗2次，每次5分钟;
③染色:在ZL新配的染色液(0.1%ANg03，3m137%甲醛)中，轻轻摇荡30分钟;
④漂洗:用ZL蒸馏水漂洗，时间不超过10秒;
⑤显影:在ZL显影液中(含无水NaZCO:609，IOmg/mlNaZsZO:400林l，37%甲醛
3ml。提前配制，4℃冰箱中预冷2小时以上)轻轻摇荡，直至出现带纹;
⑥定影:在ZL10%冰醋酸溶液中定影5分钟;
⑦漂洗:用ZL蒸馏水漂洗5分钟;
⑧干胶:室温下自然晾干24小时以上。
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4楼2010-01-22 19:52:15
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