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walker2898

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[资源] 【转帖】PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定

RNA抽提
一，准备工作
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：1ml、200ul、10ul
（2）吸头：1ml、200ul、20ul
（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个
（4） EP管1.5ml、100ul
（5）玻璃研磨器
（6）容量瓶：1000ml
（7）盐水瓶：100ml
（8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用）
2，实验器具的处理与准备
（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）
先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
（3）金属制品：（镊子等）
先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）
3，试剂配制和准备：
（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。
（2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。
（3）异丙醇：放入棕色瓶
（4）氯仿：放入棕色瓶
（5） Trizol：100ml/瓶存放于4℃
二，抽提时注意事项：
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三，抽提步骤
1．匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。
2．分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。
3． RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。
3
4． RNA的洗脱
小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。
5． RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。
TRIzol法抽提总RNA
细胞1×107
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
匀浆（要彻底，后转至EP管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
↓
颠倒混匀15S，室温5分钟
↓
4℃，离心12000rmp，15分钟
↓
转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀后-20℃中1小时
↓
4℃，离心12000rmp，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500rmp，5分钟
↓
弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录
4
逆转录（RT）
一，准备工作
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：200ul、10ul
（2）吸头：200ul、20ul
（3）EP管1.5ml、100ul
（4）水浴箱
2，实验器具的处理与准备
塑料制品：（包括吸头、EP管等）
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
3，试剂配制和准备：
（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
（2）RT中所需要的各种试剂
（3）引物浓度计算方法：（新合成的引物的稀释）假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）
二，RT时注意事项：
为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三，RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）
1，准备0.65ml的EP管
2，冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。
3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4，短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。
5，短暂离心
6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8， -20℃保存，或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）
1，准备0.65mlEP管
2，加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA
3，稍离心，100℃沸水裕1min
4，加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶
5，稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT
6， 100℃沸水裕3min灭活AMV
7，立即PCR或-20℃保存。
5
聚合酶链式反应（PCR）
二，准备工作
8，实验器具与材料：
（1）移液枪：200ul、10ul
（2）吸头：200ul、20ul
（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个
（4）EP管1.5ml、100ul
2，实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。
3, 试剂配制和准备：
(1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。
(2) PCR中所需要的各种试剂
三，PCR时注意事项：
佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四，PCR步骤
1，准备100ul EP管
2，依次在管中加入：（50ul反应体系）
ddH2O 37.5ul ×？
10mM dNTP 1ul ×？
10×PCR buffer 5ul ×？
25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？
上游引物 1ul ×？
下游引物 1ul ×？
模板cDNA 1ul
3，稍离心
4， 100℃沸水浴1分钟
5，趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6，再加入50ul液体石蜡封闭
7， 10000rmp离心1分钟
8， PCR条件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。
9，10000rmp离心5min
10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。
6
电泳鉴定
一，准备工作
1，实验器具与材料：
（1）移液枪：10ul
（2）吸头：20ul
（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个
（4）三角烧瓶：50ml一个
（5）琼脂糖
2，实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品：（包括吸头等）
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。
（2）电泳板及电泳槽：
用自来水冲洗干净备用
3, 试剂配制和准备：
(1) 电泳缓冲液（TAE）：
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。
（2）琼脂糖溶液（1.0％）：
50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。
（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。
（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer
二，电泳鉴定时注意事项：
佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。
五，电泳步骤
1， 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。
9，用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。
10，加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul 样品DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。
11，接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。
12，电泳约1小时后，紫外灯检测。

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