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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 做电转感受态时有染菌的吗
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)

[交流] 做电转感受态时有染菌的吗 已有8人参与

做了一个多月的电转了，丝毫没有一点结果，每次抗性平板上都会长出一些杂菌，空白对照也有杂菌，而且长的速度非常快，涂板不到4 h就能看到菌落，12-24 h基本长满平板，所以就算有阳性克隆子长出来，也被掩盖了，因为那种菌镜检和我的菌很像，根本不好区分。涂双层抗性平板也能生长，现在在找原因，可能的原因有以下几点：
1）感受态细胞在培养过程中染菌，这个已经通过不同抗性的液体培养基同时培养，排除在外了，因为在含抗性的液体培养基中，没有菌生长
2）感受态在制备过程中染菌，这个除离心不在无菌室外，其他步骤都在无菌室完成，离心机没有经过消毒灭菌，不知道这个染菌可能性有多大
3）电转杯没有清洗干净，电转杯在用之前是泡在75%酒精里的，然后用无菌水冲洗几次，放100%乙醇30 min以上，然后在无菌室里吹干（紫外灯开着）
4）电转过程中染菌，以前电转都没有在无菌室操作，后来把电转仪也搬到无菌室了，仍然有染菌现象；
4）制作感受态的无菌水和10%甘油也重新配了，还是染菌。
5）复苏培养2 h的过程是在摇床进行的，1.5 ml的离心管，用封口膜封住，这样会不会染菌？
能想到的原因就这么多，不知道还有其他的不？有没有类似经历的战友们，是如何对抗染菌这个棘手的问题的？
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为梦想努力。
1楼 2009-11-10 15:15:14
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
划线分离你的大肠杆菌，然后在做感受态，可能是菌种的污染
一般大肠杆菌的生长是很快的，而kan的毒性又很强，所以染菌可能性很小，即使有，一般也长不过大肠杆菌
我们组在做大肠杆菌的时候，有时候位置不够都是在外面操作的

一般这类的污染按照我们的经验都是菌种污染
曾经有好几天大家做不成转化的经历，呵呵
赞一下(2人) 回复此楼
致良知
5楼2009-11-10 21:45:43
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1,VIP+0):谢谢交流 11-10 17:07
说出你农杆菌的菌种 以及转入质粒的抗性。。
如果你 培养基中有抗生素 的话，就证明 你的菌种本身就有此抗性，没有起到筛选的作用。
赞一下(7人) 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
2楼2009-11-10 15:46:51
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 断弦的琴 at 11/10/09  15:46:
说出你农杆菌的菌种 以及转入质粒的抗性。。
如果你 培养基中有抗生素 的话，就证明 你的菌种本身就有此抗性，没有起到筛选的作用。

大肠杆菌，本身没有抗性，通过电转，阳性克隆子会带有卡那抗性，这个是不用怀疑的。感受态制备之前的菌在含卡那的液体培养基中是不长菌的
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为梦想努力。
3楼2009-11-10 16:55:48
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
哦 我理解错了 我以为你是做 农杆菌的电转呢。。
那你试下 涂布的时候少涂点啊 或者抗生素浓度加大，最好做一个梯度。
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不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
4楼2009-11-10 17:19:29
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