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haidiguyue

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 一个长引物PCR的问题

原创！

也算是pcr老手了，设计过不下200条引物，一直使用oligo6软件，几乎没有用过其它软件，主要是习惯了！

当然高手不敢当，有点经验而已，说说我前几天的PCR扩增情况吧，希望对广大坛友有所帮助，我们共勉共励，

共同进步。

话说前几天，本人设计了一对引物，长度分别为21和24个碱基，退火温度57度，30’，目标片段700bp，用普通taq扩增的非常好，然而在5‘端加了酶切位点和保护碱基之后，长度分别为32至35之间，却怎么也扩不出来，延长退火时间至45‘，降低温度至50，53度，引物二聚体贼亮，改用温度梯度，50－65度，就是无有效扩增，怎么回事？

我坐下来想了想，不由哑然失笑，大脑年久失修了！
记得刚读研究生时，我设计了很多引物，纯粹为了学习，我喜欢地用温度梯度和退火时间梯度（退火时间梯度自己每次多跑几个单独PCR实验，PCR仪比较紧张，这样也是为了节省时间，呵呵！很多引物只需15妙甚至10秒的退火时间就可以了，长引物尤其有效。

想想clontech的Smart扩增技术吧，5秒就够了，于是将退火时间缩短至15妙，扩出来了，效果很好，55－65度的宽广范围啊！

然而新问题又来了，用了toyobo的kod－plus高保真酶又扩不出来了，遂将镁离子浓度提高两倍，扩出来了，效果不好，同时两个重复，各有一个没扩出来，再想想，延长延伸时间10秒，结果完美！

引物太长，就缩短退火时间，提高退火温度，杜绝形成引物二聚体，

用高保真酶时，由于扩增效率低，适当延长延伸时间是正确地选择！

下面的顶啊！

发帖挣钱娶媳妇了！

[ Last edited by amisking on 2009-10-30 at 11:54 ]

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