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lihaoexe

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[交流] 如何给DNA片段加link

如题，我想在一些50-100bp之间的DNA片段两端加上一段序列，以便于筛选后做PCR。有没有公司做这样的服务的啊？急求！

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1楼2009-10-22 13:59:45

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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-22 14:53:

直接做PCR检测不行吗？是不是你想在不同的序列上加上不同长度的序列以便于检测呢？

不行啊，我不知道片段的序列啊，而且我这是DNA片段的混合物，相当于一个文库，我是想在其中筛选出我所要的片段然后PCR，测序

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3楼2009-10-22 15:35:19

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Originally posted by susizheng at 2009-10-22 16:34:
连T做单克隆怎么样？多筛重组子测序，估计工作量很大，而且你的片段也太短。
另外DGGE好像能够将长度一样，序列不一样的片段分离开，不知道可行不。

[ Last edited by susizheng on 2009-10-22 at 16:36 ]

筛选不是问题，我有筛选方法，关键是筛选后用PCR把得到的DNA片段扩增

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6楼2009-10-22 16:50:03

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Originally posted by susizheng at 2009-10-22 17:04:
你在片段两端加序列的目的是什么？筛选后，根据你所加的序列设计引物做PCR，将DNA片段扩增？
如果是这样的话，连T挑单克隆，富集本身也是你连进条带的扩增过程。
另外也可以以重组子为模板，利用T载通用引物，也 ...

首先，加序列的目的就是便于PCR。其次，用T载体的话，如果在筛选后连T载体，我筛选得到的DNA片段量实在太低不足以做链接，这也正是要PCR扩增的原因；如果是在筛选前连T载体，那么挑单克隆只能得到单一片段，不能筛选到我要的片段。不过还是谢谢你的建议

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8楼2009-10-22 17:12:24

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Originally posted by gyesang at 2009-10-22 19:52:
你好像吧问题说的太复杂了，不知道你的意思是不是，你知道一段DNA的序列但不知道它前面的和后面的，现在你想知道？如果是这个样子的话，那很容易就会克隆到两头未知序列啊，你先回复我，是不是我说的这个意思，然 ...

不是的，直接说就是我提取了基因组DNA，然后将其打断成了100bp左右的片段，我想在这些片段两端加一段已知序列。
不好意思，可能表述的太复杂了

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10楼2009-10-22 20:25:23

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Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-10-22 21:56:

楼主，照你的意思是说你筛片段要用特定的质粒，并且这个质粒的拷贝数不是很多，对吧？

不是的，我是指筛选过程中只有极少量的片段是符合要求的才会保留下来，其他的都会筛掉。所以想要对留下来的片段PCR扩增一下，提高浓度，之后直接测序或者链接载体就都可以了

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12楼2009-10-22 22:45:16

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