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dchty铁杆木虫 (小有名气)
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[求助]
求EDC/NHS酰胺化反应的具体步骤和详细参数已有2人参与
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最近需要将半胱氨酸乙酯的氨基连接上透明质酸的羧基，使用的是麦克林买来的半胱氨酸乙酯和10-20万分子量的透明质酸，以及阿拉丁买来的EDC和NHS。查阅文献得知EDC在接触空气时，以及溶解于水时都会发生反应被消耗，很多文献都建议在无水环境中接枝，然而由于透明质酸不溶于除去离子水以外的绝大多数溶剂，所以在氯仿、DMF、THF等溶剂中反应看似不可行。可以通过离子交换法或碱化旋蒸法得到具备DMSO溶解性的透明质酸的TBA盐，奈何目前无条件实施。 在去离子水体系中主流的连接方法为： 将320mg的透明质酸溶于80mL去离子水中（亲测室温下磁力搅拌约40min即可完全溶解）得到4g/L的水溶液，随后以0.1M浓度盐酸调pH到5.5，再加入均50mM的EDC和NHS，以0.1M浓度盐酸调pH到5.5，室温搅拌30min，加入400mg的半胱氨酸乙酯后调ph到6.0，室温搅拌4h后以12kDa透析袋在1%盐水里透析后再于去离子水中透析，然后在-50度下0.01mbar真空度中冻干得到粉末 在摸索过程中碰到如下问题： 1.理论算得在80mL去离子水中加入3uL的0.1M盐酸即可将pH调到5.43，然而实测在4g/L的透明质酸水溶液（其pH=6.55~7.00）中累计加入20uL的0.1M盐酸后测得pH=5.77，再加入5次5uL盐酸测得pH分别为5.80、5.67、5.68、5.7和5.68。起初以为透明质酸具备pH缓冲效果，但在盖上盖子，将溶液静置10min后再测发现溶液pH升到6.3。后续查得透明质酸在酸性环境下会水解，推测透明质酸在降解过程中消耗了体系中的H+导致pH值缓慢升高。不知文献中调pH至5.5的操作是如何实现的，是否需全程氮气或氩气保护（所使用的盐酸pH=1.03，浓度是没问题的）； 2.随后将错就错，继续执行加入EDC和NHS室温下磁力搅拌30min，再加入400mg半胱氨酸乙酯盐酸盐室温搅拌（选择了保守的搅拌24h而非4h）的操作，但反应完成后打开瓶盖，在一股浓浓的臭鸡蛋味中测得pH=3.96，然而文献中并没说反应完成后要调pH终止反应，而是直接将其透析，不知道此较强的酸性环境是否会降低接枝率或降低产物纯度； 3.在随后的透析过程中，有文献采取直接在去离子水中透析3天的操作，有文献选择先后在1%的NaCl水溶液和去离子水中透析，也有文献先后使用1%的NaCl水溶液、50%乙醇和去离子水透析，不知道这三种透析方式的不同之处在哪； 4.主流的做法是将EDC和NHS同时加入透明质酸溶液，搅拌10-20min后再加入半胱氨酸乙酯，但有些文献直接将透明质酸和半胱氨酸乙酯混合搅拌10-30min后再加入EDC和NHS，有的文献先将EDC加入透明质酸溶液，搅拌10-20min后再加入NHS，再搅拌10-20min后加入半胱氨酸乙酯。此外，EDC:NHS的用量之比也是众说纷纭，有说1:1的，但更多的说法是EDC用量要远超NHS。有人说EDC和NHS的用量可1/10于透明质酸，又有人说透明质酸:EDC:NHS的比例要用1:1:1甚至1:10:10，令人无所适从，不知道透明质酸:EDC:NHS的比例如何设置能使接枝成功率更高； 5.EDC活性最强的pH范围是4-6，在此范围之外仍有活性但较弱。不少文献中有在7.4或6.0的pH下做酰胺化反应的描述，然而在透明质酸接枝半胱氨酸乙酯的文献中却基本都要求将pH调到5.5，不知道是否有在>6.0甚至7.0的pH下成功制得透明质酸-半胱氨酸乙酯复合物的报导。 望各位大佬不吝指教，若答案直指要点还有更多金币奉上！ |
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