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来全克隆助您实验顺心
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传统的PCR产物克隆方法主要有两种： 一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上； 另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。 全克隆，也叫无缝克隆，同源重组法。 使用我们的试剂盒货号E086（点我了解），可以把任何基因片段，插入到你想要的任何载体中，一次实验即可到位。 第一步：线性化质粒  1.建议使用两种不同的内切酶，将目的载体线性化（双酶切制作左右两个不一样的切口，保证插入基因不会反着连） 2.不使用酶切方法，使用PCR扩增方法制作线性化载体(不推荐)，若一定要使用此方法，下游反应需要添加组分增强试剂 Cloning optimizer。线性化载体制备完成后最好通过胶回收来提纯。 3.使用5-10ng线性化载体转化感受态细胞（阴性对照），若第二天菌落大于50个，则线性化不彻底。 4.完全的载体线性化是保证实验成功的关键，即使微量的环状DNA，都可能造成较高的假阳性克隆。 第二步：添加同源臂 为目的基因添加同源臂是通过设计特殊的PCR引物，使用这对引物扩增目的基因来完成的。对于双酶切线性化的载体，PCR引物的设计为：15bp载体序列（同源臂）+完整酶切位点+目的基因特异序列 对于PCR线性化的载体，PCR引物的设计为：15bp载体序列（同源臂）+目的基因特异序列  第三步 加样反应 同时做目的基因+阳性对照+阴性对照，这一点非常关键，对于该技术不太熟悉的一定要注意。   下游进行转化铺板进行挑斑筛选就可以。 注意事项 1.可同时连接最多6个片段 2.适用于载体改造，尤其是启动子构建 3.要保持每个片段的长度相近。若出现一个片段100bp，一个片段1kb的情况，会加大连接的难度，降低成功率。 4.有需要的情况下，同源臂可由15bp延长至最多30bp 您也可以通过这个视频来了解： 我们是爱必梦生物科技有限公司，欢迎广大新老客户的咨询和建议，您可以联系以下几个方向的技术支持qq，说明您的实验需求。也可拨打电话0511-83367989转601或605进行咨询。 tina 试剂、细胞 qq:3446805487 andy 试剂、ihc诊断抗体 qq:2132083457 pluto 病毒、质粒、稳定细胞系 qq:3266996412 henry 病毒、质粒、稳定细胞系 qq:1151057111 同时有购买需求的可以直接联系各大地区销售经理进行购买（下方附有联系方式）。 点击此处跳转至网页直接联系各地区经理订购  |
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