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feitiannongying

铁杆木虫 (著名写手)

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[交流] 原核表达及诱导

导师给的课题是将拟南芥一个膜蛋白基因构建到原核表达载体进行体外诱导表达。我用的表达载体是pET30a，然后转到BL21（DE3）中进行诱导表达。在BL21（DE3）中进行诱导表达时，诱导时间用过3h、4h、5h、6h、8h，IPTG浓度用过15uM 、300uM 、500uM 、800uM、1000uM的，温度是37℃，转速是200 rpm左右；在BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达时，诱导时间用过4h、6h、，IPTG浓度用过15uM 、500uM 、1000uM的，温度是37℃，转速是200 rpm左右；在这两种宿主菌中诱导后跑SDS-PAGE发现转化子的和空载体的跑出的条带没有任何差别。重组载体没问题，测序正确并且没有移码。
从今年的3月份实习一直到现在我都在做这个课题，从一开始实验就很不顺利，到七月份才做到原核表达，而到现在还没表达出来，真的快要疯了，恳请有经验的师兄师姐给指点一下。谢谢！！

[ Last edited by amisking on 2009-8-18 at 22:12 ]

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1楼2009-08-13 09:28:50

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shmilyrodin

铜虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
feitiannongying(金币+4,VIP+0):非常感谢！！！ 8-21 07:23

也许有可能表达量很低，你看菌体制的样跑出来的PAGE根本看不出来，你先做个大量诱导，比如500ml菌液，温度和IPTG先随便定一个（建议37°，0.2mM）诱导4-5小时，然后收集菌体沉淀，加入20mMTris-HCL 20-30ml，混匀后冻于负-20°（过夜），第二天解冻后超声裂解菌体，离心后，分别取上清和沉淀制样品跑PAGE，上清和沉淀都没有的话很有可能是没有表达，祝你好运！我是用这种方法知道自己的基因表达的