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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 有关大肠杆菌CRISPR/Cas9基因敲除
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lzk234

铜虫 (小有名气)

[求助] 有关大肠杆菌CRISPR/Cas9基因敲除已有1人参与

你们有谁做过大肠杆菌BW25113  Cas9 大片段基因敲除吗，最近在做，筛选到的总是假阳性，检测Cas质粒和TargetF质粒都在，但是就是不敲除，大神们帮忙分析一下原因
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1楼2021-04-05 12:20:48
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grm枫

铁虫 (初入文坛)
是不是靶点效率不高，换靶点试试
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2楼2021-04-07 11:13:21
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

大肠杆菌敲除一般不用crispr/cas9, 用重组酶的更多
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2021-04-10 19:23:02
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by grm枫 at 2021-04-07 04:13:21
是不是靶点效率不高，换靶点试试

我怀疑是靶点问题，不过我做了双sgRNA敲除，还是不行，也可能是同源重组酶诱导的不行，导致凡是切割的没有同源重组上，都死了，长出来的都是没有经历过切割的。当然只是猜测，我也觉得靶点效率不高是最有可能的。
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4楼2021-04-13 22:16:13
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2021-04-10 12:23:02
大肠杆菌敲除一般不用crispr/cas9, 用重组酶的更多

哎，我们老板就是要让我走通CRISPR/Cas9  我也是很无奈啊
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5楼2021-04-13 22:17:09
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grm枫

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lzk234 at 2021-04-13 22:16:13
我怀疑是靶点问题，不过我做了双sgRNA敲除，还是不行，也可能是同源重组酶诱导的不行，导致凡是切割的没有同源重组上，都死了，长出来的都是没有经历过切割的。当然只是猜测，我也觉得靶点效率不高是最有可能的。...

有验证Cas质粒是正确的吗？
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6楼2021-04-14 10:39:36
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by grm枫 at 2021-04-14 03:39:36
有验证Cas质粒是正确的吗？...

这个我倒是验证过，因为我现在敲除短的片段没有问题（2k以内）长的就不行了。
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7楼2021-04-14 21:38:42
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lzk234

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by grm枫 at 2021-04-14 03:39:36
有验证Cas质粒是正确的吗？...

还有我想问一下，您做过原核单启动子下表达多个基因吗，这些基因要单独表达，而不是串联起来的。
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8楼2021-04-14 21:40:31
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匿名

本帖仅楼主可见
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9楼2021-04-23 11:45:08
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