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[交流]
PET24a，lacI基因的作用是什么
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检索了相关帖子，说是为了降低basal expression，pET28载体上T7启动子的下游还加了一段lac operator序列 pET载体表达需要有IPTG诱导，以解除对基因组上lacUV5启动子的阻遏，以及pET载体上lac operator的阻遏。 这个意思是只要不加IPTG，T7 promoter就不表达？在多克隆位点插入的目的基因也同样不表达么？ 比如插入了tet抗性基因，哪怕有抗生素胁迫，这段抗性基因（目的基因）也同样不会表达？需要在培养基中添加IPTG后，这段目的基因才会被正常表达么。 |
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5楼2021-04-05 20:30:59
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yj179491508(金币+1): 谢谢参与
yj179491508(金币+1): 谢谢参与
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目的或者说期望是这样的，实际是不一定的。 首先，要理解本底表达或泄露表达是怎么产生的。简单来讲就是，阻遏物的阻遏是不完全的，操纵子存在一个基础水平的表达，以确保胞内存在少量的半乳糖苷酶(lacZ)和半乳糖苷通透酶(lacY)，即乳糖操纵子不被诱导时，也以极少量水平表达。因为工艺问题，有机培养基里会存在痕量的乳糖，而前面说的基础水平表达确保了乳糖能进入细胞并被半乳糖苷酶水解生成半乳糖和葡萄糖，与此同时产生一个副产物：β-1, 6-别乳糖（IPTG是它的类似物），β-1, 6-别乳糖可以跟lacI表达的阻遏蛋白竞争结合，改变其构象，从而抑制阻遏蛋白跟lacO的结合，引发转录。 尽管培养基里的乳糖含量很低，或者说非常非常低，但痕量的β-1, 6-别乳糖能竞争阻遏蛋白，有机会让宿主菌的RNA聚合酶结合到DE3上的lacUV5启动子并起始T7 RNA聚合酶基因的转录，从而表达出T7 RNA聚合酶。由于T7 RNA聚合酶活性很高，转录能力也非常强，即使微量的表达也能引发载体上T7启动子启动的目的基因的转录表达，也就造成了泄露表达。 pET大多数的载体包括pET24用的是T7lac启动子，也就是T7+lacO，多加了这个lacO以后，即使有微量T7 RNA聚合酶表达了，也还是需要β-1, 6-别乳糖解除载体lacO结合的阻遏蛋白才能起始目的基因的转录，这就相当于双重保险。加了这个lacO以后，本底本底的水平肯定会下降很多，至于能否完全不表达，我认为是不一定的。 说到lacI，其实在野生型的大肠杆菌中原本就含有lacI基因，一般野生型细胞中约含10个阻遏蛋白分子，宿主菌整合的DE3上也含有一段lacI基因，但为了抑制本底表达，人们又刻意在载体上也引入了lacI基因，用于增加胞内阻遏蛋白的量来竞争结合痕量的诱导物。有兴趣的话可以翻翻以前的载体图谱，以前很多载体是没有lacI和lacO的。 有时候，即使如此，一些蛋白仍然会泄露表达并对宿主生长造成抑制，也可以结合一些其它手段加以控制。比如：培养基加适量葡萄糖，葡萄糖是一种比乳糖更好的能量来源，如果有足够的葡萄糖，细胞就不会开启乳糖操纵子，而是优先利用葡萄糖，所以能抑制本底表达。或者使用带pLysS (pLysE)质粒的宿主，该质粒能表达少量的T7溶菌酶，T7溶菌酶能够切割E.coli细胞壁肽聚糖层，也可以与T7 RNA聚合酶结合，阻止转录。其中pLysE在胞内表达累积T7溶菌酶的水平较高，会显著降低宿主菌的生长水平，并有裂解倾向，适合毒性极大的基因，而pLysS的序列是反向排列的，其表达累积溶菌酶的水平要低得多，对细胞生长影响很小，适合泄露表达对宿主有一定影响的蛋白的表达。 |
6楼2021-04-09 12:22:32
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2021-04-01 08:36
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yj179491508(金币+1): 谢谢参与
7
2021-04-01 08:37
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7
tzynew4楼
2021-04-04 22:46
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yj179491508(金币+1): 谢谢参与
bjdxyxy7楼
2021-04-09 22:23
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yj179491508(金币+1): 谢谢参与
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