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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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[交流] 扩增ORF时的引物设计求助

最近通过文库筛选获得一个包含新基因的序列,测序结果分析得到想要的ORF,设计引物获得ORF全长的时候出现了问题,恳请有经验的兄弟姐妹给予指点哈。

上游引物应该没什么问题:
CGG(保护碱基)+GGTACC(酶切位点)+ATGAATAATTCAATAACGATTGAT
下游引物设计时头都大了:
CCG(保护碱基)+GAATTC(酶切位点)+TCAAATAATTGAAGAAAAAATTAC

下游引物里面有连续的6个A,这个在扩增时候会不会出问题啊。而且G+C的含量很低,Tm值不高,错配的可能性比较大。


引物设计在行的高手帮帮忙哈。
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

反正能切胶,不用怕
2楼2009-06-15 18:01:56
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-6-15 18:01:
反正能切胶,不用怕

那我连接到表达载体上后,再测序确认下有必要么?
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3楼2009-06-15 18:05:17
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
最好是再测一下
毕竟只要经过PCR,就会有错的概率存在
尤其你是要表达蛋白的,测个序心里会有底
4楼2009-06-15 18:08:43
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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嗯,o(∩_∩)o...谢谢楼上哈,1194bp的序列,还是比较可能产生突变的,还是测序下保险。
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5楼2009-06-15 18:10:30
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