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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 非常罕见的问题，大家帮我看看。
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haylig

铜虫 (小有名气)

[交流] 非常罕见的问题，大家帮我看看。

非常罕见的问题，大家帮我看看。


各位好，有各非常紧急的问题困扰很长时间了。我构建了一个敲除载体，目的片断连到普通T载体上，然后单酶切插入卡那抗性片断，测序结果符合要求。然后以构建好的质粒为模板扩增大片断（目的片断＋卡那抗性），把大片断电击转化我的菌，进行同源重组。但是电击了几次都扩不出来大片断，只能扩出目的片段的大小，以为是假阳性；但是这次我把这些假阳性扩了一下卡那抗性，有些能扩出来，是否说明卡那抗性已经转入，但是为什么扩不出大片断，是转入后二者分开了吗，实在没的解释，希望有经验的帮我分析一下，非常头疼的问题。
还有有做过粪产碱杆菌电转化感受态的吗，能否提供一些经验。我做电转的时候是1800v，电击一次，5ms，但是我看有的文献是2000v，电击两次，作为细菌很少有击两次的，哪位有遇到过相似的问题吗？
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1楼 2009-05-25 19:19:54
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695

木虫 (职业作家)
YOU QING BANG DING
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2楼2009-05-25 19:24:28
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seapine

金虫 (正式写手)
确实蹊跷，没遇见过这样的问题！
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3楼2009-05-25 20:18:28
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sky1111

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没遇见过类似问题，帮顶一下！
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4楼2009-05-25 20:24:01
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ljl2010

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
首先声明一下：俺没做过基因打靶实验，仅供参考，说错了请别见笑
用添加卡那抗性的培养基预先筛选一下打靶后的粪产碱杆菌是不是好一些？
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5楼2009-05-25 20:52:22
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haylig

铜虫 (小有名气)
我就是先打靶然后筛选粪产碱杆菌打靶阳性的，但是每次进行菌落PCR都是没有插入卡那的小目的片断
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6楼2009-05-25 20:58:22
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大肥猫

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
目的片断连到普通T载体上之后
不是要进行单酶切还有双酶切验证吗
还要PCR验证
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感恩每一天的到来
7楼2009-05-25 20:59:04
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ljl2010

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我的意思是用卡那培养筛选打靶后的粪产碱杆菌，如果有卡那抗性（阴性的长不出）再做菌落PCR
我对粪产碱杆菌背景不了解，说错了请别见笑
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8楼2009-05-25 21:08:38
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savetheday

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的大片段是多大呢?
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Godbless
9楼2009-05-25 21:47:23
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haylig

铜虫 (小有名气)
我的大片断3000bp,我的目的片断先连到T载体上，然后单酶切，连接同样单酶切的卡那抗性片断，然后热激转化感受态，在50mg/l的卡那上筛选，进行菌落PCR，然后摇质粒进行再次扩增鉴定，都是对的。最后拿载体和扩的大片断测序，都是对的，就是片断在测序时出来了信号中断，最后又测了一次，就对了。
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10楼2009-05-27 18:08:35
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