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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pet32a质粒的引物设计
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sgba0307

铁虫 (小有名气)

[交流] pet32a质粒的引物设计

我是将目的基因插入到pet32a中在大肠杆菌中表达，现在已经将目的基因和pet32a连接了，现在关键是筛选纯的重组子，老师要我设计一对质粒载体引物来进行筛选，pet32a的引物应该怎么样来设计？谢谢！
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1楼 2009-05-19 15:42:54
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lifefamily

不是有T7通用引物么？
第一步，以T7通用引物为模板，PCR鉴定。
第二步，选PCR检验的阳性克隆，摇菌并诱导，做表达鉴定。
第三步，挑表达鉴定也呈阳性的克隆，送出测序。

其实2楼已经回答你了。
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5楼2009-05-20 13:20:23
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
你先前是怎么扩增目的基因的，那一对引物本来就可筛选了。
另外PET体系都有测序引物，应该也能帮你筛选了。

[ Last edited by 大海一孤舟 on 2009-5-19 at 17:57 ]
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2楼2009-05-19 17:56:02
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
首先这一对引物分别在pET32a 多克隆位点两端，长度在20个碱基左右，可以再长一点，不要超过30个，因为国内合成的引物质量太差。
第二，引物到克隆位点的距离可随意
第三，在克隆位点的前方取一段大约20base 的序列，命名为F，这条引物是与pET32a的正链序列相同。
在克隆位点的后方取一段大约20base 的序列，然后变成它的互补序列，这段互补序列就为另一条引物命名为R
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3楼2009-05-19 18:09:15
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