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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：蛋白怎么没表达
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muchong5577

金虫 (正式写手)

[交流] 求助：蛋白怎么没表达

各位虫友，帮帮我！
我pcr得到目的基因，TA克隆转了TOP10，然后酶切回收目的基因，连接到pET30a，转了BL21，从kan抗性板上挑到转化子，从转化子中提质粒酶切鉴定，小片段符合我目的基因的大小（大片段为载体啦），然后就IPTG诱导表达，SDS-PAGE检查怎么没看到我的目的片段呢。
ps： 一共有五个基因，从SDS胶上看，好像有一个表达啦，其它四个都没目的带。
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1楼 2009-05-16 18:58:47
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shenqicc

金虫 (小有名气)
★
muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢！ 5-16 20:02
这要看你要表达的蛋白的性质的吧，有可能本身就是有不同亚基的呢，BL21也不一定就都能表达的。。。
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2楼2009-05-16 19:35:17
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
muchong5577(金币+1,VIP+0):单独表达都没实现 ，还怎么融合表达咯. 5-16 22:09
可以考虑融合表达
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3楼2009-05-16 20:17:55
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muchong5577

金虫 (正式写手)
有几个我测序了的 start code 没突变啊
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4楼2009-05-16 22:14:30
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-17 22:30
融合表达就是为了部分解决单独不能表达的
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5楼2009-05-17 08:38:27
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mimisikai

金虫 (小有名气)
★
muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-17 22:30
多挑几个菌试试
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6楼2009-05-17 09:01:32
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
★
muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-17 22:30
不是每个转化好的菌都能表达的，还要有跟你要表达的基因有很大的关系的
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7楼2009-05-17 13:23:59
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wuer413023

至尊木虫 (文坛精英)

没事领金币
有没有形成包涵体啊
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上邪!我欲与君相知，长命无绝衰。山无陵，江水为竭，冬雷震震，夏雨雪，天地合，乃敢与君绝！
8楼2009-05-17 23:59:44
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蓝色基因

金虫 (正式写手)
★
muchong5577(金币+1,VIP+0):谢谢 5-18 13:00
首先，酶切是单酶切和双酶切都做了吗？有做测序鉴定没有？

你加入IPTG诱导时温度控制是多少？我们实验室控制在15-25度之间，37度诱导效果反而不好。

还有，加IPTG是OD值是多少，0.6么，这个会有一定的影响，但不是主要因素。
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9楼2009-05-18 09:43:56
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yoyocan

金虫 (正式写手)
IPTG 诱导很关键！ 你要多尝试几次！
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10楼2009-05-18 10:34:09
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