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[话题讨论]我在实验中做过的傻事儿-大家都来分享下
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生物学了7年，实验也做了两年了。我做过的傻事儿晕事儿迷糊事儿那叫一个数不胜数。8过，成功经验听多了，也需要谈谈失败的经验，才更有利于引以为戒 。师弟师妹们试验出了问题问我，凡是我犯过的都能很快找出失误之处~ 大家做过什么失败的实验，都来说说分享一下~最好附上解决的办法，错没事，改了就好。 套句开玩笑的话，“你有啥不开心的啊，说出来大家高兴高兴“ 废话少说，先把自个儿扔出来 1、SDS-PAGE不拆胶条 电压调到120V,电流就是上不去，跑了三四个小时之后，师姐过来一看，你胶条都没拆呢！还跑那么久！可怜的电泳仪~ 2、还是SDS-PAGE 这次是内外板放反，低的一面冲外，不知道大家用的电泳槽是不是一样，里面低一些的是正极，外面是负极。这次好一点，跑了十来分钟就发现了 3、DNA琼脂糖凝胶电泳 电源正负极插反过。 胶放反过，其实是有人把电泳槽掉了180度，以前正极在右面，那天转到左面，我没发现 所以，这两次我的样品全跑电泳槽里去了`555555555555 4、Western blot用错二抗 明明是兔的一抗，我迷迷糊糊用成了鼠的二抗，发现以后赶紧拿出来洗了两遍重新孵兔二抗，结果最后没出。 所以，用二抗前一定要认真核对啊！用错了基本可以报销啦 5、细胞污染数不胜数 我养的细胞污染过：霉菌—长得像朵蒲公英，漂亮啊~~可惜长在了我得培养皿里。 放线菌：有很长的丝，是放线菌么？ 细菌：细细黑黑的，还会游动，一天就长满了。好恶心 不知道什么的菌: 黑色的流沙状的，好象我还在这儿问过。 大部分情况下，污染了赶紧扔，别影响其他细胞就行。污染主要是操作的问题，如果担心培养液有问题，可以取一点放在新的35mm小皿里，在培养箱放一天看看。 霉菌我试过挽救，挑出去换液，不过没去干净，第二天四处开花，只好扔了。 流沙状的那种污染，我用PBS洗了好多遍,种在96孔板里，长是长起来了，快长满6孔板的时候突然又满孔流沙淹没细胞了。看来，这个方法也没用，以后可以直接仍了。 总之，污染之后挽救，远如不操作的时候小心，需要的东西在超净台里准备好照上，总拿进拿出容易把外面空气里的菌带进去。还有东西位置规划好，别把袖子在需要无菌的东西上面晃来晃去。 6、配10% SDS,总是不溶，我就放到搅拌器里搅了半天，全是泡沫~ 我又急着用，容量瓶定容的时候泡沫遮住了定容线，我一下子就把水加过线了，555，白配了 后来发现，SDS一加热还是很好溶的。不用使劲搅也能溶了。 7、做SDS-PAGE胶需要配含4% SDS的Tris溶液，一般都是最后一步加10%SDS溶液。我有一次配了1L，10%SDS溶液不够了，就直接称了SDS粉末加进去，结果一直溶不干净，加热溶了，放到室温就又会出现大量白色絮状物飘在溶液上层。可怜我配了1L啊~ 后来还是用10%SDS溶液来配才清澈的，不知道别人有发生这种情况么？但是配坏的那瓶加热溶了一样能用的，就是麻烦点儿。好在夏天到了，天一热我分装在小瓶里的就清澈了，趁夏天赶紧用，1L呢~ 8、PCR用错引物。最要命的是我是连了T载体，转化酶切测序之后才知道的。555~~ 我说大小怎么总差那么一点点 9、构建质粒，载体没切干净。人傻不能怨社会，我加了n多载体质粒，酶有点过期，时间又不够，电泳的时候切开和没切开的相差太小，我迷迷糊糊就切胶回收做连接转化了。 结果第二天满板都是菌落，挑了十几个居然只有一个阳性的，我的插入片断又用光了，结果只能搞菌海战术，前后挑了五、六十个菌落，PCR出来4个阳性的，酶切验证又错了俩，还好有一个是对的，不然全白做了。 同志们，载体酶切的时候，一定只切一点点就够用了啊！插入片断可以多切一点，载体切不干净就麻烦大了 10、质粒降解。这是最惨痛的一次教训。纯水溶的质粒，每次做细胞转染都要冻融一次，慢慢就降解了。但是有师姐之前成功的先例，我就直接拿来用了。做了无数次转染，无数次Western blot,连抗体都换了新的，就是测不到外源表达。555~ 居然是因为质粒降解没了。我怎么就没早点跑个电泳检测~以至于老师都不信任我了，浪费了多少东西，还重买了抗体，居然是质粒的问题。后来重新提了质粒，一下子就出来带了 所以，以后用别人的东西最好检测一下质量。质粒用TE溶更稳定，但是做细胞转染最好用纯水，那就只能分装成好几管避免反复冻融。还有，大提的质粒如果很多，可以乙醇沉淀风干之后直接搁4度，需要时再拿水溶解。书上说4度可以无限期保存呢。 错事太多，先说这些。以后我还会补充哒 [ Last edited by baisuilan on 2009-5-9 at 17:25 ] |
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